论文部分内容阅读
木霉菌是一类重要的生防真菌,常见种类包括哈茨木霉、绿色木霉、康宁木霉、长枝木霉等十几种,广泛分布于土壤、水体、腐烂木材和植物残体中,易于在潮湿环境中生长。木霉菌对多种植物病原真菌、细菌具有良好防效,并能诱导植物抗病性。葫芦是一类重要的观赏植物,其种植及加工目前已发展成为鲁西北地区的一重要特色产业。葫芦炭疽病是制约葫芦生产效益的第一大病害,在整个生长期均可发病,特别是对果实的危害极大,严重影响葫芦的观赏价值和商品性。化学农药的长期使用会造成环境污染,同时病原菌的抗药性会逐渐增强,使得病害愈加难于防治。本文选用长枝木霉SMF2为研究菌株,探讨了炭疽病生物防治相关问题。进行了长枝木霉菌SMF2对葫芦炭疽病菌的室内抑菌效果和盆栽葫芦炭疽病的防治效果试验,并通过分子生物学途径初步探究了该菌株的生物防治机制,为利用分子生物学的手段改良木霉菌株,进而提高木霉菌防治效率奠定了基础。通过大量试验,取得了如下结果:(1)首先采用常规组织分离法获得了葫芦炭疽病病原,通过形态学分析,结合分子生物学方法对其进行鉴定,结果表明该病原菌属于瓜刺盘孢(colletotrichum Lagenarium)。采用长枝木霉菌SMF2菌株分别对葫芦炭疽病菌开展了室内抑菌试验和盆栽葫芦炭疽病防治试验。平皿对峙培养表明:长枝木霉SMF2对该病原菌抑制效果达到83.95%;制备长枝木霉SMF2孢子悬浮液,分别对葫芦叶面喷施和根部灌施,发现葫芦炭疽病严重度均显著降低,表明其防治机制可能包含抑菌和诱导抗病性两个方面。(2)为了更好的理解长枝木霉SMF2的生防机制,我们通过分子生物学途径对该菌株的生防机理进行了研究。经过试验找到了长枝木霉菌原生质体制备的最佳条件,通过限制性内切酶介导的转化(REMI)方法获得了上百个转化子,并筛选出一个分生孢子产生量显著减少的突变体。目前,正在对该突变体开展进一步分析。通过生物信息学分析发现一NRPS基因簇上多肽合成基因TPX1附近含有一锌指结构特征的转录调控子T245,推测其可能与短肽合成有关。通过PCR技术克隆到该基因的DNA全长。基于同源重组原理,以质粒pUCATPH为载体,构建了基因T245的敲除突变载体。并通过REMI技术转化长枝木霉SMF2的原生质体。筛选基因缺失突变体的工作尚在进行当中。(3)推测木霉菌可能会分泌一些效应因子在此过程中发挥作用。首先通过生物信息学分析了长枝木霉菌SMF2菌株的分泌蛋白,找到该菌株产生的具有分泌特征的蛋白670多个,将长枝木霉SMF2与拟南芥共培养,分别提取接触前和接触后RNA进行了转录组分析,发现有414个分泌蛋白在互作过程中表达,其中21个分泌蛋白的表达量在长枝木霉SMF2与植物接触后明显高于接触前,该研究结果为进一步寻找长枝木霉SMF2与植物互作过程中的效应因子奠定了基础。