福建朱砂根离体培养及RAPD分析

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本研究以福建朱砂根优良单株的成年茎段和种胚为材料,进行了朱砂根成年材料的离体繁殖、愈伤组织培养和细胞悬浮培养等研究,并对朱砂根试管苗及其愈伤组织进行了解剖学观察;同时,利用RAPD技术进行了福建鼓山朱砂根野生群体的遗传多样性分析以及福建武平人工栽培的3种类型朱砂根实生群体的聚类分析。主要研究结果如下:1.福建朱砂根原变种(AG)、变种红凉伞(AP)以及二者中间过渡类型(AGR)成年材料的离体繁殖研究试验结果表明:较适合成年绿叶朱砂根(AG)的启动培养基为:1/2Ms或WPM+1~5mg·L-1BA+0.1mg·L-1NAA+0.2~0.5mg·L-1GA;较适合成年紫背朱砂根(AP)的启动培养基为:1/2MS+1~5mg·L-1BA+0.1mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1GA;而对于成年绿叶红心朱砂根(AGR),较适合的启动培养基则为:1/2Ms+1mg·L-1BA+0.1mg·L-1NAA+0.2~0.5mg·L-1GA。用培养基MS+3mg·L-1KT+0.01mg·L-1NAA+0.5mg·L-1GA继代培养各种类型的朱砂根芽苗可以达到一定的增殖效果。朱砂根芽苗在降低了无机盐浓度的增殖培养基上就可以完成了壮苗和生根的过程,在适当提高生长素浓度、降低分裂素浓度的培养基上生根效果更好。2.朱砂根两种成熟度的胚培养及无菌苗各部分(叶片、茎段、胚轴和胚根)的愈伤组织培养研究试验结果表明:从较成熟的果实剥离的种胚比幼嫩的果实中剥离的种胚更容易诱导愈伤的产生;胚培养产生的幼苗的各个部分在MS+0.5mg·L-12,4-D+0.01mg·L-1KT培养基中均能诱导出愈伤组织,其中胚根的愈伤组织诱导率最高:同时,胚根诱导出的白色冰砂状愈伤组织,在MS+0.5mg·L-12,4-D+0.01mg·L-1KT,隔代添加5mg·L-1AgNO3的培养基上可以很好的继代保持,并保持旺盛的增殖能力。白色冰砂状愈伤组织在不同培养基的长期培养过程中,逐渐出现了其它四种类型的愈伤组织:白色湿软状、淡黄色颗粒状、黄绿色块状和绿色块状愈伤组织。3.朱砂根愈伤组织分化根的研究试验结果表明:以降低了无机盐浓度的1/2MS为基本培养基,不添加任何激素,附加3%蔗糖就可以使淡黄色颗粒状的朱砂根愈伤组织分化丛状根;MS+0.1mg·L-12,4-D+5.0mg·L-1KT+100mg·L-1肌醇+4%蔗糖+3%甘露醇+5%椰汁的培养基中根分化率最高,但所需时间也较长;弱光有利于朱砂根愈伤组织根的分化。4.朱砂根的细胞悬浮培养研究采用5种不同类型愈伤组织(Ⅰ—白色湿软状、Ⅱ—白色冰砂状、Ⅲ—淡黄色颗粒状、Ⅳ—黄绿色块状和Ⅴ—绿色块状)作为起始材料,在去除了琼脂的MS+0.5mg·L-12,4-D+0.01mg·L-1KT液体培养基中进行悬浮培养。结果表明:Ⅱ、Ⅲ类型愈伤组织较易建立悬浮细胞系;蔗糖是朱砂根愈伤组织建立悬浮细胞系的理想碳源。5.朱砂根瘤状苗和不同类型愈伤组织的石蜡切片观察观察结果表明:瘤状苗生长点的结构与正常苗的不同。自然生长情况下,瘤状苗生长点内部细胞快速分裂,无法突破木栓化严重的外层细胞形成芽原基;离体培养条件下,瘤状苗生长点细胞不正常快速分裂,有的虽没有外层木栓化细胞的束缚,但也没有结构上的分化。另外,不同类型愈伤组织在细胞结构上也存在渐进性,愈伤组织分化根属于外起源。6.福建鼓山野生朱砂根群体中23份资源的遗传多样性分析分析结果表明:朱砂根鼓山群体的有效等位基因数Ne为1.4233,Nei氏基因多样度H为0.2524,平均等位基因数Ma为1.8060,Shannon多样性指数,为0.3852,说明福建鼓山朱砂根群体具有较高的遗传多样性;同时,供试的23份朱砂根资源在遗传上有着较高的相似系数,又证明了它们之间在遗传上保持着较高的稳定性。7.福建武平实生朱砂根3个主要类型15份朱砂根资源的聚类分析分折结果表明:当以结合距离D=0.598为界时,本研究把15份朱砂根资源分为三大类:第一类为绿叶类,第二类为红心绿叶类,第三类为紫背类,其中红心绿叶类与绿叶类之间的遗传距离要比与紫背类之间的遗传距离近;而当以结合距离D=0.668为界时,本研究又把15份朱砂根资源分为绿叶类和紫叶类两大类型。这两种分类结果都与朱砂根从形态上的分类是一致的。
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