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临床上器官移植术后病人的排斥反应防治仍面临巨大的挑战。一方面，临床主要应用的免疫抑制剂，如他克莫司(Tacrolimus，FK506)等钙调磷酸酶抑制剂，主要作用于淋巴结内的T细胞，但其淋巴结靶向性低，难以发挥最大疗效。另一方面，长期的口服或静脉施用该药物，还会产生全身毒副反应。本研究旨在制备一种淋巴结靶向的载药纳米粒，该纳米粒将免疫抑制药物高效递送至淋巴结，以期增强对移植排斥反应的抑制作用。本研究包括以下三个部分：
第一部分靶向载药介孔硅纳米粒的制备及表征
目的
制备靶向载药介孔硅纳米粒(MSNs-FK506-MECA79)，并评价其表征。
方法
(1)软模板法制备介孔硅纳米粒。溶剂蒸干法制备载药介孔硅纳米粒。超声水浴法将马来酰亚基封端的磷脂膜包裹介孔硅纳米粒。利用马来酰亚基－巯基反应连接MECA79抗体，制备靶向载药纳米粒。
(2)BrookhavenZetaPALS粒度分析仪测量纳米粒的粒径、电位及多分散系数PDI。
(3)高效液相色谱法检测靶向载药纳米粒载FK506的载药率、包封率、常温下PBS液中3天药物释放率。氮气吸脱附分析仪检测介孔硅纳米粒载药前后的孔径。激光共聚焦显微镜和流式分析仪分别定性和量化评价介孔硅纳米粒包被磷脂膜和连接MECA79抗体的效能。
结果
(1)成功制备介孔硅纳米粒，并成功包被磷脂膜，成功连接MECA79抗体。
(2)MSNs粒径174.0±2.0nm，PDI0.155，电位-16.22±2.13mV。MSNs-FK506粒径179.0±1.0nm，PDI0.152，电位-13.79±2.02mV。MSNs-FK506-MECA79粒径191.8±0.8nm，PDI0.146，电位-14.93±1.51mV。
(3)MSNs-FK506-MECA79载药率为76.27±2.28%，包封率为74.46±1.39%。体外3天累计药物释放率为72.92±3.19%。介孔硅纳米粒载药后孔径稍变小。激光共聚焦显示包膜和抗体连接成功，流式分析显示分别有95.8%和81.3%的介孔硅纳米粒成功包膜和连接抗体。
结论
本研究成功制备了高载药率的靶向载药纳米粒(MSNs-FK506-MECA79)并在体外能稳定释药。
第二部分靶向载药介孔硅纳米粒的体内靶向性和毒性检测
目的
验证靶向载药纳米粒在体内的淋巴结靶向性并评估纳米粒的生物分布及体内安全性。
方法
(1)小鼠尾静脉分别注射DiR标记的MSNs、MSNs-MECA79纳米粒。2h和24h后取材淋巴结组织，利用活体成像比较离体淋巴结荧光强度。
(2)小鼠尾静脉分别注射FITC标记的MSNs、MSNs-MECA79纳米粒。24h后取材淋巴结组织，冰冻切片染色，显微镜下比较两组淋巴结切片内的纳米粒密度。
(3)小鼠尾静脉分别注射DiR标记的MSNs、MSNs-MECA79纳米粒。2h和24h后，对主要脏器心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏进行取材，利用活体成像观察两组纳米粒在主要脏器中的分布。
(4)1、3、5、7、9天，小鼠尾静脉分别注射PBS、FK506、MSNs-FK506、MSNs-FK506-MECA79，注射后1天和10天分别采血，对主要脏器心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏进行取材，通过血常规、血生化检测和主要脏器HE染色，观察是否有毒性作用。
结果
(1)注射2h后，两组小鼠淋巴结内荧光强度无显著差异。24h后，两组淋巴结内荧光强度有显著统计学差异。
(2)注射24h后，显微镜下两组小鼠淋巴结组织切片内纳米粒数量有显著统计学差异。
(3)注射2h后，纳米粒荧光主要聚集在肺脏。24h后，纳米粒荧光则主要聚集在肝脏和脾脏。
(4)注射后1天和10天，四组小鼠血细胞、肝肾功能指标均无显著差异，各组主要脏器HE显示无明显损伤。
结论
小鼠尾静脉注射靶向纳米粒24h内能有效靶向至淋巴结且对主要脏器无毒副作用。
第三部分靶向载药介孔硅纳米粒抑制小鼠皮肤移植排斥反应的效果评价
目的
探讨淋巴结靶向载药纳米粒对皮肤移植小鼠排斥反应的抑制作用。
方法
(1)收集供体皮片，吻合受体受皮区来构建小鼠皮肤移植模型。
(2)在小鼠皮肤移植后1、3、5、7、9天，分别给小鼠尾静脉注射PBS、FK506、MSNs-FK506、MSNs-FK506-MECA79，期间及以后每天观察移植皮片状态，大于90%的皮肤坏死即视为移植皮片坏死。
(3)注射后1天和10天分别取材淋巴结组织。液质联用法测量并比较各组淋巴结内的FK506药物浓度。
(4)第10天取材移植皮片，皮片HE染色和CD3免疫组化评价并比较四组皮片的排斥程度。
结果
(1)成功构建小鼠皮肤移植模型64只。
(2)MSNs-FK506-MECA79组中，小鼠移植皮片平均生存时间最长为9.43±3.05天，与PBS组和FK506组比较，有显著统计学差异。
(3)注射后1天，各组淋巴结药物浓度无显著统计学差异。注射后10天，各组淋巴结的药物浓度差异较大，MSNs-FK506-MECA79组最高，为5569.33±783.78ng/g，与PBS组和FK506组比较，有显著统计学差异。
(4)注射后10天的皮片中，PBS组移植排斥程度最高，炎性细胞和CD3阳性的T细胞浸润最多，而MSNs-FK506-MECA79组移植排斥程度最低，炎性细胞和CD3阳性的T细胞浸润最少。
结论
淋巴结靶向载药纳米粒可显著促进药物聚集于淋巴结并有效地抑制小鼠皮肤移植排斥反应。
第一部分靶向载药介孔硅纳米粒的制备及表征
目的
制备靶向载药介孔硅纳米粒(MSNs-FK506-MECA79)，并评价其表征。
方法
(1)软模板法制备介孔硅纳米粒。溶剂蒸干法制备载药介孔硅纳米粒。超声水浴法将马来酰亚基封端的磷脂膜包裹介孔硅纳米粒。利用马来酰亚基－巯基反应连接MECA79抗体，制备靶向载药纳米粒。
(2)BrookhavenZetaPALS粒度分析仪测量纳米粒的粒径、电位及多分散系数PDI。
(3)高效液相色谱法检测靶向载药纳米粒载FK506的载药率、包封率、常温下PBS液中3天药物释放率。氮气吸脱附分析仪检测介孔硅纳米粒载药前后的孔径。激光共聚焦显微镜和流式分析仪分别定性和量化评价介孔硅纳米粒包被磷脂膜和连接MECA79抗体的效能。
结果
(1)成功制备介孔硅纳米粒，并成功包被磷脂膜，成功连接MECA79抗体。
(2)MSNs粒径174.0±2.0nm，PDI0.155，电位-16.22±2.13mV。MSNs-FK506粒径179.0±1.0nm，PDI0.152，电位-13.79±2.02mV。MSNs-FK506-MECA79粒径191.8±0.8nm，PDI0.146，电位-14.93±1.51mV。
(3)MSNs-FK506-MECA79载药率为76.27±2.28%，包封率为74.46±1.39%。体外3天累计药物释放率为72.92±3.19%。介孔硅纳米粒载药后孔径稍变小。激光共聚焦显示包膜和抗体连接成功，流式分析显示分别有95.8%和81.3%的介孔硅纳米粒成功包膜和连接抗体。
结论
本研究成功制备了高载药率的靶向载药纳米粒(MSNs-FK506-MECA79)并在体外能稳定释药。
第二部分靶向载药介孔硅纳米粒的体内靶向性和毒性检测
目的
验证靶向载药纳米粒在体内的淋巴结靶向性并评估纳米粒的生物分布及体内安全性。
方法
(1)小鼠尾静脉分别注射DiR标记的MSNs、MSNs-MECA79纳米粒。2h和24h后取材淋巴结组织，利用活体成像比较离体淋巴结荧光强度。
(2)小鼠尾静脉分别注射FITC标记的MSNs、MSNs-MECA79纳米粒。24h后取材淋巴结组织，冰冻切片染色，显微镜下比较两组淋巴结切片内的纳米粒密度。
(3)小鼠尾静脉分别注射DiR标记的MSNs、MSNs-MECA79纳米粒。2h和24h后，对主要脏器心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏进行取材，利用活体成像观察两组纳米粒在主要脏器中的分布。
(4)1、3、5、7、9天，小鼠尾静脉分别注射PBS、FK506、MSNs-FK506、MSNs-FK506-MECA79，注射后1天和10天分别采血，对主要脏器心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏进行取材，通过血常规、血生化检测和主要脏器HE染色，观察是否有毒性作用。
结果
(1)注射2h后，两组小鼠淋巴结内荧光强度无显著差异。24h后，两组淋巴结内荧光强度有显著统计学差异。
(2)注射24h后，显微镜下两组小鼠淋巴结组织切片内纳米粒数量有显著统计学差异。
(3)注射2h后，纳米粒荧光主要聚集在肺脏。24h后，纳米粒荧光则主要聚集在肝脏和脾脏。
(4)注射后1天和10天，四组小鼠血细胞、肝肾功能指标均无显著差异，各组主要脏器HE显示无明显损伤。
结论
小鼠尾静脉注射靶向纳米粒24h内能有效靶向至淋巴结且对主要脏器无毒副作用。
第三部分靶向载药介孔硅纳米粒抑制小鼠皮肤移植排斥反应的效果评价
目的
探讨淋巴结靶向载药纳米粒对皮肤移植小鼠排斥反应的抑制作用。
方法
(1)收集供体皮片，吻合受体受皮区来构建小鼠皮肤移植模型。
(2)在小鼠皮肤移植后1、3、5、7、9天，分别给小鼠尾静脉注射PBS、FK506、MSNs-FK506、MSNs-FK506-MECA79，期间及以后每天观察移植皮片状态，大于90%的皮肤坏死即视为移植皮片坏死。
(3)注射后1天和10天分别取材淋巴结组织。液质联用法测量并比较各组淋巴结内的FK506药物浓度。
(4)第10天取材移植皮片，皮片HE染色和CD3免疫组化评价并比较四组皮片的排斥程度。
结果
(1)成功构建小鼠皮肤移植模型64只。
(2)MSNs-FK506-MECA79组中，小鼠移植皮片平均生存时间最长为9.43±3.05天，与PBS组和FK506组比较，有显著统计学差异。
(3)注射后1天，各组淋巴结药物浓度无显著统计学差异。注射后10天，各组淋巴结的药物浓度差异较大，MSNs-FK506-MECA79组最高，为5569.33±783.78ng/g，与PBS组和FK506组比较，有显著统计学差异。
(4)注射后10天的皮片中，PBS组移植排斥程度最高，炎性细胞和CD3阳性的T细胞浸润最多，而MSNs-FK506-MECA79组移植排斥程度最低，炎性细胞和CD3阳性的T细胞浸润最少。
结论
淋巴结靶向载药纳米粒可显著促进药物聚集于淋巴结并有效地抑制小鼠皮肤移植排斥反应。