目的:观察经体外培养的大鼠骨髓来源内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)能否在经诱导培养下向成骨细胞分化,探讨AGEs及其膜受体蛋白RAGE是否能促进EPCs成骨分化以及MAPK信号通路在EPCs成骨分化的发生、发展中所起的作用。方法:(1)选取体重为120-150g的大鼠,以颈椎脱臼法快速处死,经75%酒精浸泡消毒后,于超净工作台中分离出双下肢股骨及胫骨,收集骨髓液,用密度梯度离心法从下肢骨髓获取单个核细胞并使用EGM-2MV培养基进行体外培养。分别于第3、7、14d时在倒置相差显微镜下对已贴壁细胞进行细胞形态学观察,在培养第7d时对培养细胞进行双染鉴定,荧光显微镜下观察到的FITC标记荆豆凝血素I(FITC-UEA-I)和DiI-标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)双染色阳性细胞即为正在分化的EPCs。(2)培养细胞中加入不同浓度AGEs作用7天,提取细胞蛋白检测不同浓度的AGEs作用后EPCs的钙化蛋白表达情况,选定20mg/ml AGEs浓度作为最适浓度后,以10mmol/lβ-甘油磷酸+20mg/ml AGEs干预EPCs 7天,免疫荧光法于荧光显微镜下观察细胞表型的变化。使用第二代内皮祖细胞,传代后培养三天,然后分别加入EGM-2MV培养基、含20mg/ml AGEs的EGM-2MV培养基、含10mmol/lβ-甘油磷酸的EGM-2MV培养基、含10mmol/lβ-甘油磷酸+20mg/ml AGEs的EGM-2MV培养基,干预处理7天,western blot观察钙化蛋白表达的变化。(3)设计沉默RAGE的siRNA,构建shRNA,用慢病毒载体进行包装,加入到二代EPCs中,用荧光显微镜观察转染效率以及最适MOI值,提取细胞蛋白,用westernblot观察rage蛋白变化确定转染效果。将细胞分为对照组、20mg/mlages组、20mg/mlages+空病毒转染组、20mg/mlages+病毒处理组,培育7天,用westernblot法观察细胞钙化蛋白变化。(4)在细胞中加入20mg/mlages,分别于0、5、15、30min时终止干预,提取细胞蛋白,用westernblot观察ages对磷酸化mapk通路蛋白的影响。将培养三天的二代epcs分为三组,即对照组、加入mapk通路抑制剂组(pd9805950umol/l、sb20358020umol/l、sp60012550umol/l)、dmso组预处理1h,更换培养基,加入20mg/ml的ages处理5min,观察相关蛋白表达变化检测抑制剂作用效果。将细胞分为对照组、ages组、ages+pd98059组、ages+sb203580组、ages+sp600125组,其中加入抑制剂组先用抑制剂干预24h,再更换培养基,加入ages培养7天,提取蛋白观察细胞钙化相关蛋白的变化。结果:(1)从骨髓获取的单个核细胞在体外经egm-2mv培养基培养后,在第3天时可观察到较多贴壁的体积较大的圆形细胞,第7天时出现集落生长、长梭状、“纺锤样”形态的细胞,经“双染”实验鉴定为正在分化的epcs,第12-14天时已出现典型的“铺路石”样形态。(2)经β-甘油磷酸+ages干预后,epcs免疫荧光观察下内皮祖细胞的表型明显减低,而成骨样表型明显增多,且提取细胞蛋白行westernblot检测到钙化相关蛋白的表达也明显增多。(3)加入ages刺激后细胞的rage蛋白表达明显增多,经sirage慢病毒转染细胞rage蛋白表达明显减低,经ages处理后,相对于对照组及空载体转染组,慢病毒转染组的钙化蛋白明显减低。(4)经ages处理后,epcs磷酸化erk1/2、p38mapk、jnk1/2表达均有所增加,经抑制剂处理后再用ages刺激,mapk磷酸化蛋白表达明显减低。相较于ages对照组,经sb203580、sp600125处理后再用ages处理的细胞钙化相关蛋白的表达明显减低,而经pd98059预处理的细胞钙化蛋白表达与ages组变化不明显。结论:(1)epcs在特定的环境下可以被诱导向成骨细胞分化,且ages可以促进这种分化的过程。(2)ages促进epcs向成骨样细胞转化与其膜受体RAGE有着密切的联系。(3)EPCs被诱导向成骨细胞分化与MAPK通路中的p38 MAPK和JNK通路相关,而与ERK通路无确切联系。