【摘 要】
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目的明确miR-130a与ZEB1和ZEB2的靶向关系,分析miR-130a在肝癌组织、肝癌细胞株中表达水平变化。通过体内、体外实验检测miR-130a对肝癌细胞增殖、转移能力的影响。方法1.Real-time PCR检测不同肝癌细胞株（SMMC-7721、Hep3B及Hep G2）及正常肝细胞株（L02）中miR-130a、ZEB1和ZEB2的表达。收集36例肝癌组织及配对癌旁组织,同样的方法检
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目的明确miR-130a与ZEB1和ZEB2的靶向关系,分析miR-130a在肝癌组织、肝癌细胞株中表达水平变化。通过体内、体外实验检测miR-130a对肝癌细胞增殖、转移能力的影响。方法1.Real-time PCR检测不同肝癌细胞株（SMMC-7721、Hep3B及Hep G2）及正常肝细胞株（L02）中miR-130a、ZEB1和ZEB2的表达。收集36例肝癌组织及配对癌旁组织,同样的方法检测体内miR-130a、ZEB1和ZEB2的表达情况,并分析其表达的相关性。2.MiR-130a与ZEB1和ZEB2的靶向关系。利用miRNA mimics和miRNA inhibitor上调和下调miR-130a表达,通过Real-time PCR及western blot检测ZEB1和ZEB2 m RNA及蛋白表达水平变化。同时,利用双荧光素酶报告基因质粒明确miR-130a对ZEB1和ZEB2的转录调控作用。3.MiR-130a对肝癌细胞恶性生物学表型的影响。瞬时增强或降低miR-130a的表达,利用MTT、克隆形成、划痕实验、transwell迁移侵袭实验分别检测miR-130a对肝癌细胞株增殖及转移能力的影响。利用慢病毒感染方法,构建miR-130a稳转细胞株SMMC-7721-miR-130a,种植于免疫缺陷鼠皮下,观察miR-130a对体内成瘤情况的影响。4.为探讨miR-130a的靶向调控ZEB1和ZEB2对肝癌细胞恶性生物学表型的影响。利用miR-130a模拟物和pc DNA3.1/ZEB1或ZEB2转染SMMC-7721细胞,分别升高miR-130a或ZEB1、ZEB2表达,再同时过表达miR-130a或ZEB1、ZEB2,通过MTT、集落形成、划痕及transwell实验检测肝癌细胞株增殖、侵袭、迁移能力变化情况。结果1.我们发现肝癌细胞株（SMMC-7721、Hep3B）中miR-130a在表达水平较正常肝细胞株L02显著下降,而ZEB1、ZEB2 m RNA则表达明显增强,在Hep G2中的表达与L02细胞株无显著差异。对36例患者肝癌临床样本的分析发现肝癌组织中miR-130a表达水平较癌旁组织miR-130a表达量明显下降（P<0.01）,同样,ZEB1、ZEB2 m RNA则表达显著增强。MiR-130a和ZEB1表达成负相关关系（Spearman相关分析,r=-0.884,P<0.01）,miR-130a和ZEB2表达水平成负相关（Spearman相关分析,r=-0.899,P<0.01）。2.双荧光素酶报告基因实验证实,miR-130a可与ZEB1和ZEB2直接作用,上调miR-130a可抑制ZEB1和ZEB2基因转录,抑制miR-130a可上调ZEB1和ZEB2基因转录,证实ZEB1和ZEB2是miR-130a的直接靶基因,受miR-130a在转录水平上的调节。3.MTT和克隆形成实验发现上调/下调miR-130a表达能明显抑制/促进肝癌细胞增殖。划痕和侵袭实验表明上调/下调miR-130a表达能明显抑制/促进肝癌细胞的迁移和侵袭能力。皮下成瘤实验与体外研究一致,过表达miR-130a组成瘤效应显著大于对照组。4.分别或同时升高miR-130a或ZEB1、ZEB2表达,结果发现单独使用ZEB1或ZEB2不能完全逆转miR-130a对肝癌细胞增殖、迁移的抑制作用;而联合使用ZEB1和ZEB2才可以较为完全阻断miR-130a对肝癌细胞增殖、迁移的抑制作用。结论1.MiR-130a在肝癌细胞和肝癌组织中低表达,ZEB1和ZEB2表达增高,miR-130a与ZEB1/ZEB2表达呈现负相关关系。2.MiR-130a通过抑制靶基因ZEB1和ZEB2转录,抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭等多种恶性生物学行为。
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