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目的:肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,仍缺乏有效的治疗手段。人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,huc MSC)可抑制肺癌进展,huc MSCs分泌的外泌体(huc MSC-derived exosomes,huc MSC-Ex)同huc MSCs生物功能相似,可用于用于肺癌治疗。小分子药物白藜芦醇(resveratrol,Res)可增强huc MSCs的生物功能,我们猜测Res预处理的huc MSCs分泌的exosomes(Res-huc MSC-Ex)对于肺癌可能具备更好的治疗效果。为此,本课题拟进一步研究Res对huc MSCs生物学特性的影响,并探究Res-huc MSC-Ex对肺癌的抑制作用,揭示相关的作用机制。方法:(1)Res对huc MSC生物特性的影响(1)huc MSCs的原代培养及鉴定:脐带组织贴壁培养获取原代huc MSCs,成骨成脂诱导培养基分别诱导huc MSCs成骨成脂分化;流式细胞术检测huc MSC表面抗原(CD44、CD105、CD45、CD34)的表达。(2)Res对huc MSC增殖、分化潜能的影响:Res处理huc MSCs后,CCK8实验和克隆形成实验检测huc MSCs的增殖,成骨成脂诱导培养分析分化潜能的改变。(3)Res对huc MSC细胞因子(IL-6、IL-8、VEGF、MCP-1)表达的影响:Res处理huc MSCs后,Luminex实验筛选分泌改变的细胞因子,酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和荧光定量PCR(q RT-PCR)分别检测细胞因子(IL-6、IL-8、MCP-1、VEGF)分泌及m RNA表达。(4)Res影响huc MSC增殖分化的机制(Wnt/β-catenin信号)的研究:Res单独或联合β-catenin激动剂CP21处理huc MSCs后,western blot或免疫荧光检测β-catenin及Wnt信号下游蛋白Cyclin D1、Cyclin D3的表达,克隆形成实验、成骨成脂诱导实验分别检测huc MSC增殖、分化能力的改变。(2)Res-huc MSC-Ex对肺癌细胞增殖、凋亡、转移的影响(1)Res-huc MSC-Ex的纯化、鉴定:收集Res预处理huc MSCs的上清,采用超速离心法提取exosomes,用透射电镜观察exosomes的形态;Nanosight可视型纳米颗粒分析仪检测exosomes的粒径分布、数量、膜电位;western blot检测exosome标志性蛋白CD9、CD63的表达;采用高效液相色谱法检测Res-huc MSC-Ex内Res的含量。(2)肺癌细胞A549对Res-huc MSC-Ex的摄取:转染慢病毒GFP表达载体,构建GFP稳定表达的细胞株(GFP-A549);用Di R标记huc MSC-Ex及Res-huc MSC-Ex,与GFP-A549共培养,激光共聚焦显微镜下观察A549细胞对exosomes的摄取。(3)Res-huc MSC-Ex对肺癌细胞迁移、增殖、凋亡的影响:huc MSC-Ex及Res-huc MSC-Ex作用于肺癌细胞株(A549、H1299)后,Transwell迁移实验、实时无标记细胞分析(RTCA)系统检测肺癌细胞迁移,CCK8实验和Annexin V/PI凋亡染色分别检测细胞增殖和凋亡。(4)小鼠肺癌模型构建及治疗:C57小鼠尾静脉注射小鼠肺癌细胞株LLC1/2,构建了肺癌转移模型;静脉注射huc MSC-Ex或Res-huc MSC-Ex进行治疗。(3)Res-huc MSC-Ex抑制肺癌进展机制的研究(1)Res-huc MSC-Ex对肺癌信号通路的影响:Res-huc MSC-Ex作用肺癌细胞(A549、H1299)后,western blot检测细胞PI3K、p-Akt、p-STAT3、p-NF-КB及Wnt信号相关分子(β-catenin、Cyclin D1、Cyclin D3)的表达;免疫荧光检测肺癌细胞(A549、H1299)β-catenin的表达;免疫组织化学染色检测Res-huc MSC-Ex及huc MSC-Ex治疗后小鼠肺癌组织β-catenin的表达。(2)Res-huc MSC-Ex抑制肺癌Wnt/β-catenin信号通路关键分子的筛查:Res处理huc MSCs,q RT-PCR筛选变化显著且可抑制Wnt/β-catenin信号通路的分子(DKK3),采用ELISA或western blot检测huc MSCs上清和exosomes内DKK3表达;免疫组织化学染色检测Res-huc MSC-Ex及huc MSC-Ex治疗后小鼠肺癌组织DKK3的表达;Western blot检测肺癌细胞(A549、H1299、H460)和正常细胞(人胚肺成纤维细胞MRC-5、hucMSC)DKK3表达差异;H1299转染慢病毒DKK3干扰载体(sh DKK3)构建H1299 DKK3表达缺陷细胞株(sh DKK3-H1299);荧光显微镜下观察GFP的表达以评估慢病毒转染效率;q RT-PCR检测H1299细胞DKK3 m RNA表达评估DKK3敲减效率;Transwell迁移实验分析H1299细胞DKK3表达缺陷后迁移能力改变。(3)Res-huc MSC-Ex内关键分子(DKK3)敲减后对肺癌转移及肺癌Wnt/β-catenin信号通路的影响:huc MSCs转染慢病毒DKK3干扰载体(sh DKK3)构建DKK3表达缺陷细胞株(sh DKK3-huc MSC),Res处理sh DKK3-huc MSC,收集上清,提取DKK3表达缺陷的huc MSC-Ex及Res-huc MSC-Ex;Transwell迁移实验、小鼠肺癌转移模型评估Res-huc MSC-Ex DKK3表达缺陷后对肺癌转移的影响;Western blot、免疫组织化学染色检测Res-huc MSC-Ex DKK3表达缺陷后对肺癌(组织/细胞)β-catenin、Cyclin D1、Cyclin D1表达的影响。结果:Huc MSCs贴壁生长,呈长梭形,可诱导成骨成脂分化,表面阳性表达CD44、CD105,阴性表达CD45、CD34;Res可抑制huc MSC IL-6、IL-8、MCP-1 m RNA表达及蛋白分泌,促进huc MSC增殖及成骨成脂分化,抑制huc MSCsβ-catenin(总蛋白/胞核蛋白)及Wnt信号下游分子(Cyclin D1、Cyclin D3)表达;利用CP21抑制β-catenin降解,可降低Res对huc MSCs的促增殖、促分化作用。Res-huc MSC-Ex直径在110 nm左右,呈杯装,表达CD9和CD63;Res可促进huc MSC-Ex分泌,提高huc MSC-Ex的膜电位。Res-huc MSC-Ex被肺癌细胞摄取后,可抑制肺癌细胞迁移,不影响细胞增殖、凋亡;肺癌模型显示Res-huc MSC-Ex及huc MSC-Ex均可降低小鼠肺部肿瘤结节数量,但Res-huc MSC-Ex的抑制作用更强。Res-huc MSC-Ex不影响肺癌炎症相关的信号通路(STAT3、NF-КB、Akt、PI3K信号通路),抑制肺癌细胞或小鼠肺癌组织Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白(β-catenin、Cyclin D1、Cyclin D3)的表达;利用CP21抑制β-catenin降解,可逆转Cyclin D3的表达,废除Res-huc MSC-Ex对肺癌细胞迁移的抑制作用;Res促进huc MSCs DKK3 m RNA表达及蛋白分泌,使DKK3在Res-huc MSC-Ex中富集;DKK3在肺癌细胞株(A549、H1299、H460)中的表达显著低于MRC-5和huc MSCs,DKK3表达缺陷可促进肺癌细胞迁移。Res-huc MSC-Ex DKK3表达缺陷后不能抑制肺癌转移,不能诱导小鼠肺癌组织DKK3表达,对肺癌细胞或小鼠肺癌组织Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白(β-catenin、Cyclin D1、Cyclin D3)表达的抑制作用也消失。结论:Res降低huc MSC炎症因子(IL-6、IL-8、MCP-1)表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路,促进huc MSCs增殖、分化,诱导huc MSC-Ex分泌,促进huc MSC-Ex内富集DKK3蛋白;Res-huc MSC-Ex可转运DKK3蛋白拮抗肺癌Wnt/β-catenin信号,抑制肺癌转移。