近年来,抗生素滥用的现象受到了广泛的关注。抗生素相关性腹泻(Antibiotic associated diarrhea,AAD)是临床中常见的副作用之一,可对肠道菌群和免疫系统造成较大干扰。益生菌、益生元等微生态制剂常被用于AAD的预防和治疗。益生菌是定殖在人体内,对宿主有益的活性微生物,能通过抑制致病菌来调节肠道菌群紊乱,改善肠道微环境。人参是我国名贵中药材,有大补元气、抗炎、提高免疫力等功效。利用益生菌对人参进行发酵,一方面可发挥益生菌的肠道菌调节功能,同时在发酵过程中可对人参中的有效物质进行转化,提高人参药效成分的利用率,从而实现协同增效的功能,共同发挥调节肠道菌、抗炎和提高免疫力的作用。为探讨发酵人参对AAD的治疗作用,本文首先采用液态发酵的方法建立益生菌/人参发酵体系,并对发酵条件进行优化;然后以AAD模型大鼠为研究载体,评价发酵人参对其生理及病理状态的改善作用,并从肠道菌群与肠道炎症调节两个方面评价发酵人参对于AAD的治疗作用,以期为AAD提供新的治疗方案,同时为发酵人参的开发提供新的方向。本文具体研究内容及结果如下:(1)益生菌/人参发酵体系的建立采用18株益生菌对人参进行液态发酵,并以益生菌活菌数为指标对菌种进行优选,建立适宜的益生菌/人参发酵体系。筛选得到一株适宜在人参中生长的益生菌,经过16S rRNA鉴定,该株益生菌为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentium sp.)。(2)发酵条件的优化及人参皂苷含量、抗氧化活性的测定利用响应面法对益生菌/人参发酵体系进行优化,优化后的最佳发酵条件为:发酵时间42h、人参添加量8.03%、温度28.24℃、接种量2%,预测活菌数为4.372×1013CFU/mL,经过验证,优化结果可靠。采用HPLC法分析发酵前后人参皂苷含量变化,并测定了发酵前后SOD酶活性的变化。结果表明发酵后人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rd的含量均有一定升高,SOD酶活性较发酵前提高了 26%。(3)发酵人参对AAD大鼠的治疗作用初探利用三联抗生素灌胃建立了 ADD大鼠模型,采用不同剂量的发酵人参对AAD大鼠进行干预,考察其对大鼠体重及粪便含水量的影响;通过H&E染色观察结肠组织细胞的形态变化;通过荧光定量PCR技术测定粪便中五种常见肠道菌及总菌的丰度;ELISA检测肠组织中炎症因子的变化情况。结果表明,发酵人参可改善抗生素引起的体重增长变慢、活动异常、腹泻等症状,并在一定程度上恢复结肠的异常形态。抗生素会导致大鼠肠道菌的紊乱,qPCR分析显示自然恢复5天后,总菌、粪肠球菌、鼠乳杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌无法恢复至正常水平。而经发酵人参治疗后,总菌与上述四种菌的丰度恢复至正常水平。PCoA分析发现,发酵人参组大鼠肠道菌群谱发生了向正常组恢复的趋势。此外,抗生素干预会导致大鼠结肠中TLR4与NF-κB的表达显著增加,而经过发酵人参治疗后,其表达下降为正常水平。上述结果表明,发酵人参对抗生素诱导的腹泻、结肠组织结构变异、肠道菌群紊乱和肠道炎症均有一定的修复作用。不同给药剂量的发酵人参治疗效果存在差异,其中0.5 g/kg/d剂量下的治疗效果最佳。(4)发酵人参与人参-益生菌混合物对肠道菌群及肠道炎症的影响利用Illumina MiSeq测序和Luminex检测技术分析发酵人参对AAD大鼠肠道菌群及结肠中炎症因子表达的影响,通过比较发酵人参与人参-益生菌混合物对AAD大鼠影响的差异,阐述益生菌发酵过程对人参药效的影响。结果表明,抗生素的干预会导致肠道菌群物种丰度和多样性的减少,发酵人参可恢复物种丰度和多样性至正常水平。从目水平的物种差异分析来看,经过发酵人参治疗后,益生菌Lactobacillales目相对丰度增加,条件致病菌Erysipelotrichales目相对丰度减少,Bacteroidales目、Clostridiales目恢复至正常水平。属水平的物种差异分析显示,经过发酵人参治疗后,相对丰度显著上升的菌株有Lactobacillus sp.和Candidatus Stoquefichus sp.;下降的菌株有Bacteroides sp.、Clostridioides sp.和Fournierella sp.。其中Lactobacillus为肠道菌群中常见的益生菌,Clostridioides为肠道菌群中常见的致病菌。说明在目和属水平,发酵人参可恢复有益菌的丰度,减少有害菌的丰度。此外,由Heapmap和PCoA分析可知,发酵人参治疗后的AAD大鼠肠道菌有恢复至正常的趋势。通过比较发酵人参和人参-益生菌混合物对肠道菌群治疗的差异,发现人参-益生菌混合物的肠道菌群恢复能力较弱,说明发酵过程可提高人参的肠道菌群恢复能力。结肠组织中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的表达分析发现,发酵人参可恢复炎症因子的异常表达,而人参-益生菌混合物的恢复能力较弱,说明发酵过程可提高人参的抗炎能力。肠道菌群与炎症因子表达关联性分析发现,肠道菌中某些菌株与炎症因子的表达呈现一定的关联性,包括:Lachnospiraceae sp.属、Ruminoococcaceae sp.属、Prevotllaaceae sp.属Lactobacillus sp.属、Clostridioides sp.属、Parasutterella sp.属等。结合在属水平的肠道菌群变化推测:发酵人参可通过升高Lactobacillus sp.降低Bacteroides sp.、Clostridioides sp.的丰度来缓解肠道炎症的发生。综上所述,本文建立并优化了益生菌/人参液态发酵体系,测定了发酵前后人参皂苷含量的变化;以AAD大鼠为研究载体,在肠道菌群结构和肠道炎症调节两个方面评价了发酵人参对AAD的治疗作用,在此基础上探讨了肠道菌群结构与肠道炎症之间的相互关系。本研究为发酵人参的AAD治疗提供了基础数据,同时为人参的开发及应用提供了研究依据。