人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)基因编码的反式激活蛋白(trans-activator transcription,TAT)中的蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)能够高效、快速地携带外源性蛋白穿入几乎所有的真核细胞,而进入细胞浆。由于其具有核定位信号,因此也能定位于细胞核内。同时PTD具有不影响其携带的目的蛋白功能的特点。Foxp3是FOX(forkhead box)家族转录因子中的一员,是调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的特异性标志,同时对Treg的发生、发育、功能的维持与发挥方面起着关键作用。研究发现表达外源FOXP3可使非调节性T细胞具有类似调节性T细胞样的表型及免疫抑制功能。FOXP3具有四个功能结构域,N端为富含脯氨酸的区域(PRD)具有调控功能,C端为叉头状结构域(FKH)具有与核酸结合和调控作用,中间为锌指结构和亮氨酸拉链区域。因此去除N末端PRD区域的hFOXP3片段(△PRD)和去除C末端FKH区域的hFOXP3片段(hFOXP3-△FKH)可能均具有抑制活性的功能区域。目的:克隆hFOXP3-△PRD(简写为△PRD)/hFOXP3-△FKH(简写为△FKH)基因片段;构建带PTD和PTD-eGFP的原核表达载体,表达、纯化PTD-△PRD、PTD-eGFP-△PRD、PTD-△FKH、PTD-eGFP-△FKH融合蛋白,并初步探讨其生物学功能,为进一步研究hFOXP3的免疫抑制机制奠定基础。方法:(1)利用PCR技术扩增获得人△PRD和△FKH基因,将其克隆至pMD18-T载体,进行单、双酶切鉴定及序列分析。(2)将测序正确的△PRD和△FKH基因片段克隆到带穿膜序列的pET28a-PTD/pET28a-PTD-eGFP原核表达载体中,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达,获得带有His标签的融合蛋白,经Ni2~+-IMAC亲和柱纯化融合蛋白和PD-10脱盐柱除盐获得纯化蛋白,Western-blot技术检测融合蛋白表达的正确性。(3)流式细胞术检测融合蛋白穿越细胞膜进入人急性白血病T淋巴细胞瘤株Jurkat E6.1T细胞中的能力和量效关系,Western-blot分析和共聚焦显微镜观察确认融合蛋白进入细胞浆和细胞核。通过淋巴细胞增殖抑制实验初步分析融合蛋白对T细胞活化增殖的影响。(4) RT-PCR检测IL-2和IL-10的mRNA表达水平。结果:(1)正确构建了pET28a-PTD-△PRD、pET28a-PTD-eGFP-△PRD和pET28a-PTD-△FKH、pET28a-PTD-eGFP-△FKH融合蛋白表达载体,表达并纯化了人PTD-△PRD、PTD-eGFP-△PRD、PTD-△FKH、PTD-eGFP-△FKH融合蛋白。(2)通过流式细胞术分析证实表达的融合蛋白均能高效的转导入细胞内,且发现融合蛋白PTD-eGFP-△FKH在640nM,与细胞共育2h时蛋白穿入细胞效率最高,PTD-eGFP-△PRD 1280nM与细胞共育4h时穿膜效率最高。(3)经Western-blot和共聚焦显微镜观察确认融合蛋白能够进入细胞浆和细胞核。(4)同时经CCK8法细胞增殖试验证明PTD-△PRD融合蛋白抑制PBMC活化增殖的能力高于PTD-△FKH融合蛋白,说明C末端的FKH区域在hFOXP3的抑制功能中起重要的作用,而N末端的富含脯氨酸区域也具有一定的抑制功能。(5)从细胞因子IL-2和IL-10的mRNA的水平分析发现PTD-△PRD/△FKH融合蛋白均具有一定的生物学作用。PTD-△PRD和PTD-△FKH能下调IL-2表达,而上调IL-10的表达。结论成功表达具有生物学活性的PTD-△PRD和PTD-△FKH融合蛋白,流式细胞术、共聚焦显微镜和western blot证实融合蛋白能有效地进入细胞并定位于细胞核内,CCK8法增殖试验和RT-PCR结果初步证明我们的融合蛋白具有抑制功能,为进一步研究hFOXP3的功能片段及其免疫抑制机制奠定了基础。