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肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是临床上常见的恶性肿瘤,极大地危害人类健康。乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)感染是导致HCC的主要原因之一。乙肝病毒X蛋白(HBV X protein, HBx)由HBV基因组的X开放阅读框编码,被证实是一种重要的癌蛋白,能促进细胞增殖、迁移、侵袭等。肿瘤的发生与细胞代谢的紊乱密切相关,鞘脂代谢是脂代谢中的重要一环,鞘脂代谢的异常能导致肿瘤、动脉粥样硬化等疾病。鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1, SPHK1)是细胞内鞘脂代谢途径的重要限速酶,产生的代谢产物1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate, S1P)是细胞信号转导过程中重要的效应分子,其参与调控细胞诸多的生理活动。研究发现,SPHK1是细胞中调节S1P生成的最主要分子,与多种肿瘤的过度增殖有密切的关系。HBx促进肝癌细胞增殖的分子机制尚不是十分清楚,为了进一步阐明HBx促进肝癌细胞增殖的具体机制,本文探究了SPHK1在HBx促进肝癌细胞增殖中的作用。主要研究内容如下：第一部分：HBx对SPHK1表达的影响我们首先探讨了HBx与SPHK1之间的关系,先在mRNA水平上分析了38对肝癌组织与癌旁组织样本中的SPHK1和HBx,结果发现SPHK1和HBx呈正相关性；然后检测HBx转基因鼠HCC组织中的SPHK1表达水平,发现SPHK1在6月龄和18月龄的HBx转基因鼠中高表达；在瞬时转染HBx的L02和HepG2的细胞系、稳定表达HBx的HepG2-X和HepG2.2.15细胞系中,应用RT-PCR和Western blot技术发现HBx能剂量依赖性上调SPHK1的mRNA和蛋白水平,相反,用psi-HBx质粒沉默HBx后能剂量依赖性下调SPHK1的mRNA和蛋白水平。上述结果揭示HBx能上调肝癌细胞中的SPHK1的表达。第二部分：HBx对SPHK1基因启动子的调节作用为了解释HBx上调SPHK1的机制,我们研究了HBx对SPHK1启动子活性的影响。通过双荧光素酶报告基因检测发现,过表达HBx能增强SPHK1启动子的活性,而把HBx沉默后明显降低了SPHK1启动子的活性。利用生物信息学手段对SPHK1启动子进行分析,我们发现SPHK1启动子的-20/-15区域有一个AP2a结合位点。设计引物把该AP2a结合位点缺失的启动子序列构建到pGL3-Basic质粒上,命名为pGL3-320-mut,双荧光素酶报告基因检测发现pGL3-320-mut的活性明显低于pGL3-320,说明AP2α在SPHK1的转录中起到重要作用。染色质免疫共沉淀实验进一步说明AP2α能与SPHK1的启动子直接结合；同时,干扰AP2a后显著减弱了HBx对SPHK1启动子的激活作用,且SPHK1的表达水平呈剂量依赖性下调,表明AP2a在HBx激活SPHK1启动子的过程中扮演重要角色。在HepG2、HepG2-X和HepG2.2.15中过表达HBx后发现HBx能上调AP2α的表达。因此,我们认为HBx通过转录因子AP2α激活SPHK1启动子活性,从而上调SPHK1的表达。第三部分：HBx通过SPHK1促进肝癌细胞增殖的作用为了阐明SPHK1在HBx促肿瘤生长效应中的所起的作用,我们进行了一系列体外与体内实验。将SPHK1的siRNA片段转染到HepG2-X和L02-X中,应用MTT实验与平板克隆形成实验探讨SPHK1对肝癌细胞增殖作用的影响。结果发现,与对照组肝癌细胞相比,转染si-SPHK1的肝癌细胞的增殖明显受到抑制,说明SPHK1与HBx的促肝癌细胞增殖的过程密切相关。裸鼠皮下成瘤实验表明HBx能明显促进肿瘤的生长,而si-SPHK1能有效地阻碍HBx的这一促瘤作用。采用免疫组织化学技术检测瘤组织中的增殖标记物Ki-67的表达情况,结果显示si-SPHK1明显抑制了Ki-67的表达,这进一步证明si-SPHK1能有效地阻碍HBx的促瘤作用。这些结果表明在体外和体内,HBx通过SPHK1促进了肝癌细胞的增殖。综上所述,本研究发现HBx通过转录因子AP2a上调SPHK1的表达,从而促进肝癌细胞的增殖。本研究为进一步阐明HBx的致癌机制提供了新的观点,对肝癌的预防、诊断与治疗具有重要的理论意义。