禽流感（A！）是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的疾病，被国际兽疫局确定为I类烈性传染病，对养禽业的危害甚大，高致病力禽流感病毒（HPAIV）造成的死亡率高达100o。1997年，在香港有18人感染了HSNIt流感病毒。1999年，又有2人感染了HgNZ禽流感病毒。这表明川 可有限地感染人，更突出了其公共卫生意义。由于AIV的变异快、亚型多，使禽流感的防治面临严峻挑战。因此，探讨禽流感新型防制策略显得尤为迫切。 本研究根据反义NA作用机制，以AIV复制过程中起重要作用的保守基因NP。PB、PBZNP为靶标，设计与其 InRNA互补的特异性反义 RNA以及特异性剪切的核酶，探讨在细胞水平上抑制AIV夏制的策略，为防制A＊提供新的途径。 i据反义 NA作用机理，以 AIV A／ChickenjXifljiang／96（H14NS）全长 cDNA及 5’端三50hp 含完整的5’端非编码区和部分编码区），以及AIV A／Goose／Guangdongil／96（HSNI）PB CDNA 5’端 365hP和 93 hp（都包含完整的 5端非编码区及部分编码区）为目的基因，反向插入到逆转录病毒载体p；xSN中，分别命名为plxas－NP、plxas－5’－NP、Plxass’－PB和 Plxas－PB。用磷酸钙共沉淀和脂质体介导法转染包装细胞系 PA3 7。经G4旧筛选抗性克隆，扩增单个丸隆，收耿培养上情中的重组逆转录病毒。将重组逆转录病毒感染滴定细胞系N！H3＊Z，各筛选到高滴度产毒细胞克隆、将重组逆转录病毒感染AIV许可性细胞系MDCK，叭DNA水平险测到目的基因的整合，用巢式r－PCR法证实日的基因的表达。uh明已建立了表达特异性反义RNA的抗A＊的细胞系，分别命名J］ MPXAs－NP、MplX。－5’－NP、MP［Xffes－PBI和 MpIXAs－P81、用 AIV接种抗 A＊的细胞系后，通过血凝试验表明，逆转录病毒介导的特异性反义NA抑制了AIV的复制。 根据 Symons介绍的锤头状核酶结构，以 AIV A／Goose／Guangdong／l／96（HSNI）PBI。PBZ mRNA为靶标，借助汁算机软件辅助设汁，并分析底物的二级结构，找到可能成人核酶切割的 2个位点（PB的 151位点；PBZ的 44位点），设汁并构建了带有 5、is－RZ和3’－ets－Rz的自剪切体外转录质粒，将其分别命乞j］卜ZPB、As44lPBZJ同时将核％切割底物基囚片段克隆入体外转录质粒 T－vector上，分别命名 IJ Tpb、TpbZ；经体外转录分别获取以’‘卜标记的核酶和靶A，升对靶A进行核酶的体外切割实验。酶动力学分析表明，RzPB、RzPBZ均有特异、高效地切割两个靶 RNA的活性。用 XhOI．Sail双酶切 ePB、RzPBZ，将带有 5－ets－s和 3’－ets、Rz的自剪切核酶，分别单独充隆或串联克隆入plxHS中，KJ建了逆转录病毒核酶表达质粒和鸟枪型逆转录病毒核酶表达质粒，将其分别命名为 pxRzPB、plxRzP82和 plXAB。用脂质体介导法转染包装细胞系 PA3 7，经 G4旧筛选抗性克隆，扩增培养；收脓房养上清中的重组逆转录病毒，盂庆文迎转录瞩霉介导的特异性反义nA和幢回抑制禽流日清每复制的研灭00I年6月以其感染川V许可性细胞系MDCK，通过PCR从DNA水平上证明＊o”基因的整合，巢式 RT．PCR方法检测到 Neo”基因的表达，从而建立了表达特异性核酶的抗 AIV的细胞系，分别命名为 MplaltzrB、帅lxRz44 PBZ和 MplxAB。将 AIV ＄染此抗性细胞系后，血凝试验结果表明，逆转录病毒介导的特异性切割核酶抑制了AIV的复制，并且多靶标鸟枪型核酶具有协同作用。 为了证实绿色荧光蛋白（gTeen luorescent protein，GFP）作为报告基因和筛选标记的可行性，本研究构建了绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pCDNA；GFP，并观察了其在 MDCK细胞系中的表达。以 Notl切取 pCIGFP的 GFP基因后插入真核表达载体pcDNA；中，以BamHI鉴定方向，用pCDNA。GFP以LpofectAMINET’vi转染MDCK培养物，经 G4筛选阳性克隆，荧光显微镜下观崇。结果证实，成功地构建了含 GFP cDNA的真核表达质粒pCDNA3GFP，转染的MDCK阳性克隆在荧光显微镜下呈绿色。GFP基困可在MDCK细胞中表达，并发出绿色荧光，是一良好的报告基因和筛选标记。 本研究首次探讨了特异性反义RNA和核酶对AIV复制的抑制作用。这些结果表明，特异性反义RNA和核酶在基因水平上直接抑制AIV，可以作为一种有潜力的抗AIV制剂，对A＊的防制以及人类IV的基因治疗有重要意义，也为培育抗AIV的转基因动物模型以及抗川 的转基因禽类育种莫定了物质基础。