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缢蛏是我国主要的海水养殖贝类。贝类缺乏后天获得性特异免疫,先天免疫是唯一的抵御屏障。补体作为最重要的先天免疫系统之一,在抵御疾病的过程中扮演着重要的角色。目前针对贝类补体C3及其亚型的序列和结构研究最为常见,功能方面几乎未见报道。本文对缢蛏补体C3三个亚型基因的结构、表达和溶血反应进行了研究。1.通过本实验室已经建立的转录组信息库获得缢蛏三个C3基因段片段序列并进行克隆验证,使用RACE技术获得cDNA全长序列。三个基因基本信息分别为:ScC3全长6950bp,包括5256bp的开放阅读框(ORF),翻译为1752个氨基酸的编码蛋白序列,分子量为197.34kDa;ScC3-2全长6294bp,包括5225bp的ORF,编码为1741个氨基酸,分子量为196.13kDa;ScC3-3全长5965bp,包括5105bp的ORF,编码为1701个氨基酸,分子量为191.39kDa。缢蛏三个C3基因的氨基酸组成存在较大差异,ScC3和ScC3-2具有67%的一致性,ScC3和ScC3-3具有35%的一致性,ScC3-2和ScC3-3具有38%的一致性。在蛋白二级和3D结构中三者较为相似。比对三个C3基因的氨基酸结构序列显示三者均具有补体C3特征的8大结构域,仅ScC3-3在硫酯键(有两个氨基酸不保守)和α-γ链接位点(不存在)上存在差异。系统发育树结果说明,ScC3和ScC3-2结构相似度高,而ScC3-3与前二者相似度较低,但三者均是典型C3基因。2.通过实时荧光定量PCR检测了C3基因在缢蛏健康组织和早期发育时期的表达模式。结果显示ScC3、ScC3-2和ScC3-3均广泛表达,其中在幼体中具有一定的表达特征,且三个C3基因存在显著差异。利用副溶血弧菌侵染缢蛏健康个体,荧光定量分析结果显示ScC3在血淋巴(8h)和肝脏(72h)中显著上调,ScC3-2在血淋巴(8h)中显著上调,ScC3-3在血淋巴(24h)和肝脏(72h)中显著上调。针对不同致病菌和不同的免疫组织,三个C3基因表达量存在显著差异。利用溶壁微球菌侵染缢蛏健康个体,荧光定量分析结果显示ScC3、ScC3-2和ScC3-3都在血淋巴(24h)中显著下调在肝脏(4h)中显著上调。结果揭示了三个C3基因均参与了免疫应答,是有效的免疫基因,但是三者之间可能存在功能差异。3.多个理化因子被用于探索缢蛏血清溶血反应最佳的条件。结果显示溶血反应依赖钙镁离子和弱碱性pH,溶血率受温度(灭活温度为50℃)、时间、缢蛏血清浓度(最佳比例为4:6缢蛏血清:2%兔血)和作用方式(最佳孵育方式为反应全程低速震荡)的影响。依据以上结果表明补体C3主导的缢蛏血清溶血反应物理条件与高等哺乳动物存在一定差异,推测缢蛏等贝类开管式循环可能存在适应其特点和生活环境的自身独特的免疫方式。各个生化因子被用于探索缢蛏溶血反应的启动情况,显示溶血反应能被LPS、酵母聚糖、FLA和PGN激活,能被甲胺和PMSF抑制。4.制备筛选了三个C3基因特异性良好的抗体,并通过免疫沉淀(IP)实验证明了抗体对各自基因存在特异抑制活性。使用特异性抗体抑制缢蛏血清中C3蛋白的活性,从而研究其主导的溶血功能。结果显示两个C3基因(ScC3和ScC3-2)具有主导溶血的功能。利用Western Blot和激光共聚焦分析了三个C3蛋白在抵抗异源抗原过程的蛋白定位,三者均于细胞或细菌表面发挥作用。以上显示缢蛏ScC3和ScC3-2在功能上极其相似,而ScC3-3功能上差异较大;另外结合PMSF对缢蛏血清溶血反应的影响表明缢蛏补体C3是一个不耐热,需要激活,具有丝氨酸蛋白酶活性在细胞膜表面主导缢蛏血清完成溶血反应的免疫功能基因。5.根据缢蛏的转录组数据表明缢蛏补体系统缺乏C3下游的基因,设计引物使用同源重组法构建了三个缢蛏C3基因的重组表达载体(pEGFP-N1),在小鼠RAW264.7细胞(小鼠巨噬细胞)中进行模拟过表达实验。三个C3基因在有效转染前提下均能启动小鼠补体系统。结合LPS和免疫复合物对缢蛏血清溶血反应的影响以及IP实验,表明缢蛏补体系统为需要经过激活物(细菌多糖)活化的多分子参与的典型级联反应。