研究背景与研究目的：心力衰竭是许多心血管疾病的终末阶段,是主要的致死原因。心肌肥厚和心室重塑是心衰进展的主要病理基础。心肌肥厚是一个复杂的病理过程,以心肌细胞蛋白质合成增多和细胞体积增大为特征,逐步进展为不可逆的病理变化。心肌肥厚及心肌重塑在促使心脏结构从可逆到不可逆以及心功能从代偿到失代偿的转变中起着重要作用。虽然一定程度的心肌肥厚有利于减轻心室壁压力,维持负荷加重时的心排出量,然而持续存在的促肥厚刺激信号促使心肌肥厚加重,心功能恶化,是促进心衰进展的主要因素。有效抑制心肌肥厚进展、改善心肌重塑成为治疗心衰的重要手段。许多临床和实验研究均显示在动物模型中解除结扎的主动脉后或临床上病人行主动脉瓣置换术等撤除压力负荷的措施,使得已发生肥厚的心肌得以恢复,在解除压力负荷后心肌肥厚消退,产生了一些抗肥厚因子发挥着作用。也有研究报道,在动物实验中,短暂的抗高血压治疗可以发挥较长时间的抗心肌肥厚作用而保护心功能。那么,在短期或长期解除压力负荷后,心脏能否获得对后续更长时间促肥厚刺激的抵抗能力呢?目前对这一方面还没有相关的研究报道。1986年Murry等首次提出了心肌缺血预适应的概念,这一现象是指短时间的缺血再灌注处理使心脏对随后更持久的缺血损伤产生显著的保护作用。之后大量实验证实,这一现象普遍存在于不同的器官组织,在心脏也存在着其他非缺血预适应,包括机械牵拉、缺氧、代谢应激和药物等。目前多数研究都关注在缺血预适应现象,而其他的非缺血预适应很少有研究。那么心肌肥厚中是否存在着预适应现象呢?有研究证实类似程度的压力负荷(如高血压)可能会引起不同程度的心肌肥厚,心肌肥厚在原发性高血压病人中的患病率不到50%,提示一些病人中可能存在着能抵抗促肥厚刺激的保护因素。有研究报道心脏压力负荷撤除后基因表达发生了改变,其中一些抗肥厚基因表达增高,发挥抗肥厚作用。已有研究显示在动物模型上给与适当间断的运动预适应,可以改善之后持续压力负荷诱导的心肌肥厚。通过怎样的方式可以有效诱导这些心肌肥厚抑制因子来抵抗心肌肥厚,仍需要进一步研究。因此,在上述的研究基础上,我们提出了一个大胆的假设,即”心肌肥厚预适应”,短期肥厚刺激可以使心脏对后续持久的肥厚刺激产生抵抗作用,并减缓心衰的进展。在前期实验中我们已经验证了肥厚预刺激可增强心肌细胞的抗肥厚能力,延缓从心力衰竭的进程,改善心功能,这一作用可能与在解除肥厚刺激因素后S100A8/A9的表达上调有关,但其在心肌肥厚预适应中的作用机制尚不清楚, 而S100A8和S100A9作为钙结合蛋白S100家族的成员,可能通过Ca2+依赖方式与特异性靶点相互作用发挥生物活性,Ca2+作为重要的第二信使,在心肌肥厚的发生发展中起重要作用心肌肥厚的进展中,在Ca2+依赖的心肌肥厚信号通路中,calcineurin-NFAT信号通路是重要的通路之一。因此我们假设S100A8/A9可能通过调节calcineurin-NFAT信号通路参与了心肌肥厚预适应。本实验的研究目的是进一步明确S100A8/A9在心肌肥厚预适应中的表达情况及持续时间,并通过重组蛋白S100A8/A9和构建重组慢病毒敲低S100A8/A9明确其在心肌肥厚预适应中的作用机制。研究方法：(一)TAC诱导心肌肥厚预适应对心功能的影响1.1主动脉弓缩窄术(TAC)诱导小鼠心肌肥厚模型的建立8-10周龄C57BL/6雄性小鼠,体重20-25g,用甲苯噻嗪(5mg/kg)和氯胺酮(100mg/kg)腹腔注射麻醉,呼吸机辅助呼吸。胸骨左侧第二肋间开胸,暴露主动脉弓,钝性分离主动脉弓后用7-0号丝线结扎主动脉弓和27G垫针,打结后撤出垫针造成60-80%的血管狭窄。假手术组开胸后,仅用丝线穿过主动脉弓后轻轻的打结,不造成血管狭窄,之后关胸。预适应模型中,在特定的时间后,解开主动脉弓的缝线,解除血管狭窄,一段时间后再次行主动脉弓缩窄术。TAC诱导心肌肥厚预适应实验中,小鼠随机分组,每组6-7只,分为4组：假手术(sham组)、TAC组、TAC预适应1组(PRE1+TAC组)和TAC预适应2组(PRE2+TAC组)。SHAM组和TAC组分别观察6周；PRE1+TAC组在TAC术3d后解除结扎,4d后再次行TAC后观察6w; PRE2+TAC组是在行TAC术后1w,解除结扎1w后再次开胸行TAC后,同样观察6w。1.2超声心动图以及左室血流动力学测定心脏结构功能在TAC术后7d、21d、35d时,超声心动图评估小鼠心脏结构和功能。二维超声在胸骨旁获得左心室短轴图像,M型超声测量左室收缩和舒张末期内径(LVESd、LVEDd),左室后壁收缩末和舒张末厚度(Pws、Pwd),计算左室短轴缩短率：LVFS= (LVEDd-LVESd)/LVEDd×100。TAC 6w后每组小鼠处死取材前,用Millar导管测定左室血流动力学指标。1.3 Western Blot检测S100A8/A9蛋白的表达水平撤除肥厚刺激对S100A8/A9表达的影响：实验分为4组：1)Sham组;2)TAC1w组：行TAC后1w;3)T3dD1d组：行TAC术3d后,解除狭窄1d;4)T1wDld组：行TAC术1w后,解除狭窄1d。肥厚预适应刺激对S100A8/A9表达的影响及持续时间：实验分为5组：1)Sham组；2)TAC 1 w组：行TAC后1w;3)T1wDld组：行TAC术1w后,解除狭窄1d;4)Tlw/Dlw/Tlw组：行TAC术1w后,解除狭窄1w,再行TAC1w; 5) T1w/D1w/T6w组：行TAC术1w后,解除狭窄1w,再行TAC 6w。(二)肥厚预适应上调的S100A8/A9对体外心肌细胞肥厚的作用及机制2.1去甲肾上腺素刺激新生大鼠心肌细胞(NRCs)分离培养新生大鼠心肌细胞,实验分为四组：(1)去甲肾上腺素(NE)刺激组：1μmol/L去甲肾上腺素(溶于DMEM培养基)刺激48h;(2)NE预适应1组(PRE1+NE):1μmol/L去甲肾上腺素刺激12h,更换新的DMEM培养基去除刺激12h,再用NE刺激48h；(3)NE预适应2组(PRE2+NE):1μ/L去甲肾上腺素刺激12h,更换新的DMEM培养基去除刺激24h,再用NE刺激48h;(4)对照组(control组)：DMEM培养48h。Western blot检测S100A8和S100A9的蛋白表达。2.2重组蛋白S100A8/A9对NE刺激的心肌细胞和成纤维细胞的作用分离培养新生大鼠心肌细胞和成纤维细胞,实验分为8个组：(1)NE刺激组：1μmol/L去甲肾上腺素(溶于DMEM培养基)刺激48h;(2)NE+重组蛋白S100A8组(NE+S100A8):NE和S100A8 (1μg/mL)共刺激48h；(3)NE+重组蛋白S100A9组(NE+S100A9):NE和S100A9 (1μg/mL)共刺激48h；(4)NE+重组蛋白S100A8/A9组(NE+S100A8/A9):NE和S100A8/A9 (1μg/mL)共刺激48h;(5)对照组(Control):DMEM培养48h;(6)重组蛋白S100A8组(S100A8):S100A8(1pg/mL)刺激48h;(7)重组蛋白S100A9组(S100A9)：S100A9 (1 μg/mL)刺激48h； (8)重组蛋白S100A8/A9组(S100A8/A9):S100A8/A9 (1μg/mL)共刺激48h。RT-PCR检测心肌细胞ANP,β-MHC和成纤维细胞前胶原Ⅰ型(procollagenⅠ)和Ⅲ型(procollagenⅢ)基因的表达水平,免疫荧光检测心肌细胞面积,Western blot检测心肌细胞钙调神经磷酸酶(calcineurin)和活化T细胞核因子(NFAT)的核转位。(三)重组慢病毒过表达及敲低S100A8/A9对心肌细胞及成纤维细胞肥厚预适应的作用3.1重组慢病毒的构建及鉴定构建携带S100A8/A9全长编码序列及其干扰RNA序列的重组慢病毒,感染心肌细胞(感染复数MOI=5),感染24h后更换培养基,继续培养72h后,显微镜下观察细胞荧光,RT-PCR和Western Blot检测S100A8/A9的表达,鉴定重组慢病毒的感染效率及过表达／敲低的作用。3.2细胞活性检测过表达S100A8/A9重组慢病毒不同感染复数(MOI分别为5、10、15)感染心肌细胞以及重组蛋白S100A8/A9不同浓度(1μg/mL、10μg/mL)刺激心肌细胞后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测心肌细胞的存活情况。3.3敲低S100A8/A9对心肌细胞和成纤维细胞肥厚预适应的作用敲低S100A8和S100A9重组慢病毒Lv-ShRNA-S100A8和Lv-ShRNA-S100A9)感染心肌细胞及成纤维细胞(感染复数MOI=5)72h后,RT-PCR检测心肌细胞ANP、β-MHC和成纤维细胞前胶原Ⅰ型(procollagenⅠ)和Ⅲ型(procollagenⅢ)基因表达水平,免疫荧光检测各组心肌细胞面积,Western blot检测心肌细胞钙调神经磷酸酶(calcineurin)的表达和活化T细胞核因子(NFAT)的核转位情况。研究结果：(一)：心肌肥厚预适应在体心肌肥厚的保护作用,并上调S100A8/A9的表达1.1肥厚预适应改善心功能超声心动图检查结果表明,7d、21d、35dTAC组小鼠左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩末内径(LVESD)、左室舒张／收缩后壁厚度(Pwd/Pws)随着时间而显著增加,而左室短轴缩短率(LVFS)明显下降。(P≤0.001)。与TAC组相比,心肌肥厚预适应组明显延缓了左室室壁厚度的增加、左室心腔的增大以及心室短轴缩短率的降低(与TAC组相比,P值均<0.05),而两个预适应组之间相比没有统计学差异。TAC 6w后,超声心动图显示PRE1+TAC组和PRE2+TAC组小鼠与TAC组相比心脏左室内径(LVD)更小(P均<0.05),而左室后壁厚度与TAC组相比没有统计学差异。(可能与TAC组心腔扩大导致增加的室壁厚度变薄有关)；心脏血流动力学结果显示PRE1+TAC组和PRE2+TAC组小鼠与TAC组相比左室舒张末压力(LVEDP)降低和左室收缩力(LV contractility)升高,差异有统计学差异(与TAC组相比,P值均<0.05),而2个预适应组与TAC组相比左室收缩压力(LVSP),左室压力最大上升速率(LVdp/dt max)左室压力最大下降速率(LVdp/dt min)没有统计学差异。1.2撤除肥厚刺激和肥厚预适应上调S100A8/A9的表达撤除肥厚刺激对S100A8/A9表达的影响：Western Blot结果证实TAC 3d或1w,解除狭窄1d后心肌组织S100A8和S100A9蛋白表达水平显著升高；肥厚预适应刺激对S100A8/A9表达的影响及持续时间：肥厚预适应刺激后S100A8以及S100A9的表达明显升高,同时检测了S100A8和S100A9表达上调维持的时间,发现在T1wD1wTlw以及TlwD1wT6w两组中S100A8/A9的表达仍保持升高,证明在恢复肥厚刺激后S100A8/A9能够维持1-6w的高水平表达。(二)肥厚预适应在体外心肌细胞中上调S100A8/A9以及重组蛋白S100A8/A9的作用机制2.1 NE预适应刺激心肌细胞上调S100A8/A9的表达Western blot结果证实预适应1组(PRE1+NE)和NE预适应2组(PRE2+NE)S100A8和S100A9表达较NE组明显升高,在细胞水平验证了肥厚预适应刺激可上调S100A8/A9的表达。2.2重组蛋白S100A8/A9改善体外心肌肥厚和纤维化在细胞实验中,我们发现与NE组相比,重组蛋白S100A8、S100A9或S100A8/A9处理均可减小心肌细胞面积;RT-PCR结果显示NE刺激组与对照组相比,心肌细胞ANP、β-MHC以及成纤维细胞procollagen I和Ⅲ的基因表达水平上调,而给予S100A8、S100A9或S100A8/A9重组蛋白后可以抑制上述基因表达水平;Western blot结果表明NE刺激可以明显上调心肌细胞calcineurin的表达,而重组蛋白S100A8、S100A9或S100A8/A9处理后可以抑制这种改变。同时检测NFATc3在心肌细胞定位,结果显示对照组NFATc3主要位于细胞浆,NE刺激后转入细胞核内,而给予重组蛋白S100A8、S100A9(或S100A8/A9)均可抑制NE诱导的NFATc3核转位。(三)重组慢病毒敲低S100A8/A9抵消心肌肥厚预适应的抗肥厚作用上述结果证实了S100A8/A9在心肌肥厚中的重要作用,之后我们构建了过表达和敲低S100A8/A9的重组慢病毒来进一步明确其在心肌肥厚预适应现象中的作用机制。3.1重组慢病毒的构建和鉴定构建携带S100A8 (MRP-8)或S100A9 (MRP-14) shRNA序列的重组慢病毒敲低S100A8和A9的表达,构建携带S100A8 (MRP-8)或A9 (MRP-14)的重组慢病毒过表达S100A8/A9。免疫荧光证实过表达和敲低S100A8/A9的重组慢病毒有效感染心肌细胞,MOI=5时可以有效感染70%以上的细胞。RT-PCR结果验证了过表达S100A8和S100A9重组慢病毒(Lv-S100A8和Lv-S100A9)可上调S100A8或A9达200多倍以上,显著高于肥厚预适应上调的S100A8和S100A9的表达量(约6倍)；RT-PCR和Western Blot均证实重组慢病毒S100A8和S100A9 (Lv-ShRNA-S100A8和Lv-ShRNA-S100A9)感染心肌细胞后可明显抑制S100A8和S100A9的表达。3.2细胞活性检测MTT结果显示高剂量的S100A8和S100A9增加了心肌细胞的死亡,说明S100A8和A9的作用为剂量依赖性。因此,我们选用了敲低S100A8/A9的重组慢病毒来进行后续的机制研究。3.3敲低S100A8/A9抵消体外心肌肥厚预适应的抗肥厚作用与预适应组相比,分别或同时敲低S100A8和A9的表达可抵消肥厚预适应作用,增加了心肌细胞面积,上调心肌细胞ANP和β-MHC的基因表达,增加calcineurin蛋白表达水平和NFAT3的核转位；并使成纤维细胞procollagen I和Ⅲ的基因表达水平升高。结论：一、肥厚预适应可上调S100A8/A9的表达,在恢复肥厚刺激后能够维持1-6w的高水平表达。体外给予重组蛋白S100A8/A9可以通过抑制calcineurin/NFAT促肥厚信号通路参与肥厚预适应的抗心肌肥厚作用。二、重组慢病毒敲低S100A8/A9的表达,可抵消心肌肥厚预适应对calcineurin/NFAT促肥厚信号通路的抑制作用,使心肌细胞胚胎基因ANP、 β-MHC和成纤维细胞procollagen Ⅰ、Ⅲ的基因表达水平升高,增加心肌细胞calcineurin的蛋白表达及NFATc3的核转位,使心肌细胞面积增加,抵消了心肌肥厚预适应的抗肥厚作用。