肾纤维化常被认为是慢性肾病（Chronic kidney disease,CKD）的潜在病理过程,是慢性肾脏损伤及损伤适应性修复的最终病理改变。导致肾纤维化的因素多种多样,除了糖尿病和高血压等常见的慢性疾病以外,各种原因导致的肾脏损伤也是引发远期肾纤维化的重要原因。在肾纤维化过程中,上皮间充质转化（EMT）往往伴随着上皮标志物如E-钙黏蛋白（E-cadherin）的逐渐丧失以及间充质标记物如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的逐渐上调。长期反复或者严重的刺激会导致肾小管上皮细胞（TECs）损伤及去分化、间质炎症细胞浸润,进而分泌各种促炎症和促纤维化细胞因子。在以上各种因素共同作用下,肾间质肌成纤维细胞（myofibroblast）数量明显增加,导致细胞外基质（ECM）-如纤维连接蛋白（Fibronectin,FN）和胶原蛋白I（Collagen I,COL-I）的过度沉积,正常肾脏组织逐渐被取代,进而形成纤维化。在许多相关研究中,TGF-β/Smad信号通路都起着举足轻重的作用,转化生长因子β（TGF-β）更是其中关键性的细胞因素。组织蛋白酶S（Cathepsin S,CTSS）来源于半胱氨酸蛋白酶家族,可参与多种ECM成分（如胶原蛋白、纤维粘连蛋白等）的降解。我们前期对压力灌注对不同程度积水肾脏的影响进行研究时发现积水肾脏中CTSS表达量显著升高。因此我们认为CTSS可能与肾纤维化的发生有关,并进一步参与其调控。所以,在本研究中,我们探讨了CTSS在压力灌注所致不同程度积水肾脏纤维化中所起的作用并进行了具体的机制分析。实验结果表明:在压力灌注所致不同程度积水肾纤维化模型以及TGF-β诱导的肾小管上皮细胞纤维化模型中,CTSS的表达量都明显上升,CTSS可以调节ECM的沉积,也可以通过TGF-β/Smad信号通路干预EMT过程进而对纤维化过程产生影响。综上所述:CTSS可以对ECM的沉积和EMT产生影响,能够通过TGF-β/Smad信号通路对肾纤维化过程进行调节。第一部分不同程度积水肾脏的纤维化改变目的:探讨不同程度积水肾脏的纤维化改变,并进一步给予梯度压力灌注,观察灌注压对于积水肾脏纤维化的影响。方法:通过单侧输尿管结扎（UUO）法构建不同程度肾积水模型。轻度积水组（M组）和重度积水组（S组）分别在3d和7d后超声检查确认积水形成。每组分别给予梯度压力灌注（0、20、60、100mm Hg）,按灌注压力不同分为四个亚组（M0-M3,S0-S3）。然后通过Masson染色对纤维化程度进行评估,通过免疫组化、western blot以及q PCR检测α-平滑肌肌动蛋白（Alpha smooth muscle Actin,α-SMA）,纤维粘连蛋白（fibronectin,FN）,E-钙粘蛋白（E-Cadherin,E-Ca）以及胶原蛋白I（Collagen I,COL-I）的表达情况。结果:与对照组（N组）相比,M0组和S0组COL-I,FN和α-SMA的表达水平显著上升,E-Cadherin表达水平显著下降。M组给予梯度灌注压力,各亚组COL-I和FN表达无明显变化。S组给予梯度灌注压力,当灌注压达到60 mm Hg时,COL-I和FN的表达水平显著上升。在M组和S组中,当压力达到20mm Hg时,观察到α-SMA的表达水平显著增加。在S组中,当灌注压达到20mm Hg时,E-钙粘蛋白的表达显著降低,当压力达到60mm Hg时,在M组中观察到相同的变化。结论:与轻度积水肾脏相比,重度积水肾脏的纤维化更为严重;且重度积水肾脏对灌注压力的耐受更低。第二部分CTSS与不同程度积水肾脏纤维化的关系目的:探讨CTSS在积水肾纤维化以及TGF-β诱导的肾小管上皮细胞纤维化过程中的作用。方法:采用单侧输尿管结扎法构建不同程度肾积水模型。轻度积水组（M组）和重度积水组（S组）分别在3d和7d后超声检查确认积水形成。然后通过Masson染色对纤维化程度进行评估,通过免疫组化、western blot以及q PCR检测α-平滑肌肌动蛋白（Alpha smooth muscle Actin,α-SMA）,纤维粘连蛋白（fibronectin,FN）,E-钙粘蛋白（E-Cadherin,E-Ca）以及胶原蛋白I（Collagen I,COL-I）的表达情况。抑制剂组（Mi、Si）则在给予相同处理的同时给予CTSS特异性抑制剂LY3000328干预。同样检测纤维化程度以及纤维化相关指标的变化情况。体外实验则通过免疫组化、western blot以及q PCR检测TGF-β诱导的小鼠肾小管上皮细胞（TCMK-1）纤维化模型中si RNA-CTSS使用前后α-SMA、E-Ca、FN以及COL-I的表达情况。结果:与N组相比,M组和S组中CTSS的表达水平显著上升,但是仅在S组中观察到COL-I和FN表达量的显著增加。与N组相比,M组和S组TGF-β1和α-SMA的表达水平显著上升,而E-cadherin的表达显著降低。当CTSS表达受到抑制时,TGF-β1,α-SMA,FN,COL-I的表达水平均有不同程度的升高,而E-cadherin的表达降低。在TGF-β1刺激的TCMK-1细胞系中观察到CTSS表达量的显著增加。α-SMA、COL-I和FN表达量显著增加而E-cadherin的表达显著降低。而在si RNA-CTSS进行干预后则发生相反的变化。结论:在积水肾脏和TGF-β诱导的纤维化模型中,CTSS的表达量都明显增加;抑制CTSS可使纤维化加重。提示CTSS与肾纤维化之间存在密切关系。第三部分CTSS参与调节不同程度积水肾脏纤维化的分子机制目的:探讨CTSS对TGF-β/Smad信号通路的调节作用,明确CTSS对UUO肾纤维化及TGF-β诱导的纤维化进行调节的具体信号机制。方法:UUO法构建不同程度积水肾模型,通过western blot以及q PCR对TGF-β、Smad2、Smad3、p Smad2和p Smad3的表达情况进行检测。以评估TGF-β/Smad信号通路的激活情况。抑制剂组（Mi组、Si组）在给予输尿管结扎后给予CTSS特异性抑制剂干预,通过western blot以及q PC对抑制剂干预后TGF-β、Smad2、Smad3、p Smad2和p Smad3的表达情况进行检测。建立TGF-β诱导纤维化模型,通过western blot以及q PC对si RNA-CTSS干预前后Smad2、Smad3、p Smad2和p Smad3的表达情况进行检测。不同程度积水肾脏给予梯度压力灌注,观察TGF-β/Smad信号通路相关指标的变化情况。结果:在UUO肾纤维化模型中,与N组相比,M组和S组TGF-β1,Smad2,Smad3和p Smad2/3的表达水平显著升高。当CTSS表达受到抑制时,TGF-β1,Smad2,Smad3和p Smad2/3的表达水平均有不同程度的升高。在TGF-β1刺激的TCMK-1细胞系中可观察到CTSS的明显增加。ECM沉积和EMT也得到加强。在针对CTSS的小干扰RNA干预后发生相反的结果。而给予梯度压力灌注后,TGF-β1,Smad2,Smad3和p Smad2/3的表达量都有明显的上升。结论:积水、灌注压、CTSS均可对TGF-β信号通路产生影响;进而影响到肾纤维化的进展。