植物分生组织是存在于植物的一定部位,具有持续性或周期性分裂能力的细胞群。植物分生组织通过其自身的增殖和分化能够维持自身增殖,同时产生其他组织与器官,使植物不断生长。根据细胞来源不同,分生组织可以分为原分生组织、初生分生组织和次生分生组织。初生分生组织和次生分生组织可以产生植物体的主要组织器官。初生分生组织位于植物根、茎及分枝的顶端,包括根尖分生组织和茎尖分生组织,分别产生植物的地下部分和地上部分,实现植株的径向生长。维管形成层组织属于植物的次生分生组织,其通过增殖和分化向内形成木质部,向外形成韧皮部,使根和茎不断生长加粗。CLE多肽是一种重要的植物多肽激素,作为一种分泌肽通过结合细胞表面的膜受体蛋白传递信号,参与调控植物多种的生长与发育过程。拟南芥CLE基因家族共有32个成员,编码26种成熟的CLE多肽,成熟CLE多肽由12/13个氨基酸组成。依据是否参与调控茎尖分生组织和根尖分生组织中干细胞的增殖与分化过程将CLE多肽分为A和B两类:A类CLE多肽参与调控茎尖分生组织和根尖分生组织中干细胞的增殖与分化过程,而B类CLE多肽则不参与此过程的调控。近年来关于CLE多肽在植物茎尖分生组织和根尖分生组织的功能研究已取得了重要进展。CLV3和CLE40分别参与调控茎尖分生组织和根尖远端分生组织中干细胞的增殖与分化之间的平衡;同时CLE多肽在不同分生组织的调控机制上存在一定的保守性。然而对于CLE多肽在维管形成层分生组织发育中的功能研究则相对较少,尤其是CLE多肽在韧皮部发育中的功能研究更是相对空白。本课题中我们希望找到在韧皮部发育中发挥重要功能的CLE多肽。我们的研究首先分离了一个在植物韧皮部表达的CLE基因-SvCLE。以此为开端,我们研究了SvCLE 基因在植物维管韧皮部发育中的功能。本实验以拟南芥为研究材料,通过生理学、分子生物学、遗传学以及生物化学多种手段和技术得到如下实验结果:2.根长实验结果表明SvCLE多肽能够显著抑制野生型拟南芥植株Col-0和Ler主根的生长,但并不能抑制突变体rp主根的生长,表明SvCLE多肽能够抑制拟南芥主根的生长,并且在此调控过程中依赖于受体RP。2.外源施加SvCLE多肽对韧皮部特异标记转基因植物APLpro:GUS表达影响的实验结果显示用SvCLE多肽处理植株3小时和12小时不能引起GUS信号的消亡,然而处理24小时和48小时能够引起GUS信号的显著消亡,表明SvCLE多肽能够导致拟南芥韧皮部细胞的消亡。与此实验结果相一致qPCR的实验结果表明SvCLE多肽能够显著的抑制APL基因表达,然而并不能抑制RP中APL基因的表达,这也说明SvCLE多肽介导的拟南芥韧皮部细胞消亡的信号途径依赖于受体RP。3.外源施加SvCLE多肽对植物维管形成层标记转基因植物ATHB8pro:GUS表达影响的实验结果表明SvCLE多肽不能引起A7HB8pro:GUS信号消亡,与此实验结果相一致qPCR的实验结果表明SvCLE多肽不影响ATHB8基因表达。ATHB8是形成层和初生木质部的标记基因,这说明SvCLE多肽不影响拟南芥(原)形成层和初生木质部的发育。4.利用我们前期获得的pRP:GUS转基因植物,染色实验结果发现RP基因在维管组织中表达;同时qPCR的实验结果显示RP中APL基因的表达量低于Ler中APL基因的表达量。将rp和APLpro:GUS植株进行杂交获得纯合杂交植株后,用SvCLE多肽处理杂交植株,结果显示SvCLE多肽不能引起杂交植株中GUS信号消亡,这些结果表明类受体蛋白RP确实作为受体介导了 SvCLE多肽诱导的韧皮部细胞消亡。5.通过对SvCLE基因T-DNA插入突变体的基因型筛选,我们获得SvCLE基因的T-DNA插入纯合突变体svcle-10。对svcle-10纯合突变体植株的表型分析显示svcle-10的主根生长情况和其他表型与野生型植株没有明显区别。6.构建了35S:SvCLE表达载体并通过转化野生型植株获得了超表达SvCLE基因的转基因植株阳性苗。对转基因植株阳性苗进行表型观察发现超表达SvCLE基因能够严重抑制野生型植株的生长和发育,最终导致转基因植株的死亡。然而35S:SvCLE转化rp依然可以获得健康的转基因植株。这些结果也进一步显示SvCLE多肽对植株生长发育的调控依赖于受体RP。7.BAM3和RP的BIFC蛋白互作实验结果表明BAM3和RP并不互作,表明它们可能各自独立的介导SvCLE多肽的信号来调控韧皮部的发育。我们的研究结果发现了一个与SvCLE-BAM3并行独立的调控韧皮部发育的信号途径SvCLE-RP,丰富和完善韧皮部分子调控的机理。同时也例证了同一个CLE多肽可能被不同的受体识别。我们的研究结果也为农林作物尤其是木本植物的维管发育研究提供理论借鉴。