灭多威属氨基甲酸酯类农药,化学名S-甲基-N[(甲基氨基甲酰)-氧]硫代乙酰胺,分子式C5H10N2S,1968年在美国注册上市,1997年被世界野生动物基金会列为环境雌激素,是当前全球使用最广泛的杀虫剂之一。由于灭多威在土壤中移动性强、水中溶解度高(57.9 g-L-1,25℃)以及半衰期长,因此容易通过地表径流、淋溶、干/湿沉降等方式进入水体。目前,许多国家的水体中都检测到灭多威残留(0-97μg-L-1),甚至在喷洒灭多威的田头水渠中曾检测到其浓度高达0.65 mg·L-1。由于灭多威在农业生产中的使用量大、毒性强、环境水体中检出率高、残留量大和具有内分泌干扰作用,其已经对水生态系统造成一定危害,并可能威胁人类饮用水源水安全。然而目前有关灭多威对水生生物特别是鱼类的环境毒理学研究薄弱,因此急需开展灭多威对鱼类等水生生物的毒性效应研究,从而对灭多威的水生态安全性做出科学评价,并为鱼类栖息地等水域的灭多威残留限量标准制(修)订提供基础性资料。为此,本论文以具有较高经济价值并常被用作毒理学试验研究材料的罗非鱼(O.niloticus)为供试生物,采用更新式静态水体接触染毒法研究了环境雌激素灭多威对罗非鱼的急性毒性；并在此基础上,以血清睾酮(T)、11-酮基睾酮(11-KT)、雌二醇(E2)、卵黄蛋白原(VTG)和性体指数(GSI)为指标,研究了不同作用时间(0d,6d、12 d、18 d、24 d、30 d)和不同暴露浓度(0.2 μg·-1、2μg·L-1、20 μg·L-1200μg·L-1)的灭多威对雄罗非鱼内分泌系统的影响；以下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)促性腺激素释放激素(GnRH)、雌激素受体(ER)、细胞色素P450芳香化酶(CYP19)、促性腺激素释放激素受体(GnRHR)、促性腺激素(FSH、LH)、雄激素受体(AR)、卵泡刺激素受体(FSHR)、黄体生成素受体(LHR)、类固醇合成急性调节蛋白(StAR)、3α-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)、卵黄蛋白原(VTG)等基因的mRNA表达量为指标,研究了暴露时间为30 d时不同浓度(0.2 μg·L-1、2μg·L-1、20μg·L-1、200μg·L-1)的灭多威对雄罗非鱼的内分泌干扰作用机理;以血清、肝脏、肾脏中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)为指标,研究了不同作用时间(0 d、6 d、12 d、18 d、24 d、30 d)和不同浓度(0.2μg·L-1、 2μg·L-1、20μg·L-1、200μg·L-1)的灭多威对雄罗非鱼抗氧化防御功能的影响。同时,开展了为期18d的恢复试验研究,评价灭多威对生物体造成的毒性损伤是否具有可逆性。以期通过上述研究,更加全面深入地了解灭多威对雄鱼生殖内分泌系统和抗氧化防御功能的损伤程度及其作用机理。急性毒性试验研究结果表明,灭多威对罗非鱼的24 h、48 h、96hLC50分别为1.25mg·L-1、0.75 mg·L-1、0.43 mg·L-1,安全浓度为0.043 mg·L-1。按照农药毒性分级标准,灭多威对罗非鱼是极高毒农药,很容易导致鱼类急性中毒死亡。灭多威对雄罗非鱼血清性类固醇激素和VTG水平以及GSI影响的研究结果表明,在02μg·L-1和2 gg.L-1暴露浓度下,灭多威对雄罗非鱼血清性激素和VTG水平没有产生显著(p>0.05)影响,因此从性类固醇激素和VTG的角度分析,2μg·L-1可以作为灭多威对雄罗非鱼无雌激素效应的参考阂值。在20μg·L-1和200μg·L-1暴露浓度下,灭多威对雄罗非鱼血清性激素和VTG水平产生了显著(p<0.05)影响；其中血清E2和VTG被显著(p<0.05)诱导,最大诱导值分别出现在200 μg.L-1浓度下暴露后的24d和30 d,分别为相应对照组的261.81%和2156.95%；血清T和11-KT被显著(p<0.05)抑制,最小抑制值均出现在200μg·L-1浓度下暴露后的30d,分别为相应对照组的43.78%和41.22%。灭多威对雄罗非鱼GSI影响的研究结果显示,在02μg·L-、2μg·L-1和20μg·L-1三个暴露浓度下,GSI没有发生显著(p>0.05)变化,但在200 gg·L-1高浓度下,灭多威对GSI产生了显著(p<0.05)的抑制作用,最小抑制值出现在暴露后的30 d,为对照组的76.64%。本试验中上述参数的显著变化表明浓度不低于20μg·L-1的灭多威暴露能够对雄罗非鱼性类固醇激素合成和代谢产生显著影响,造成机体性激素分泌异常,从而导致雄罗非鱼生殖功能障碍。同时,对比雄罗非鱼上述各项参数对灭多威的敏感性,本试验认为雄罗非鱼GSI以及血清VTG、E2、T和11-KT对灭多威的敏感性表现为：VTG>E2>11-KT>T>GSI,显示出VTG是指示灭多威污染的敏感指标。灭多威对雄罗非鱼HPG轴性激素相关基因mRNA表达量影响的研究结果表明,在0.2μg·L-1和2μg·L-1浓度下暴露30 d时,灭多威对雄罗非鱼HPG轴性激素相关基因mRNA表达量没有产生显著(p>0.05)影响,因此从性激素相关基因mRNA表达量的角度分析,2μg·L-1可以作为灭多威对雄罗非鱼无雌激素效应的参考阈值。在20μg·L-1和200 μg·L‘浓度下暴露30 d时,灭多威对雄罗非鱼HPG轴性激素相关基因mRNA表达量产生了显著(p<0.05)影响；其中下丘脑GnRH2、GnRH3、ERα、ERβ基因,垂体GnRHR、FSHp基因,精巢CYP19a、FSHR、ERα基因以及肝脏VTG、ERa基因的mRNA表达量被显著(p<0.05)诱导,最大诱导值分别出现在200μg·L-1、20 μg·L-1、200 μg·L-1、20 μg·L-1,20μg·L-1、20μg·L-1,200μg·L-1、20μg·L-1以及200μg·L-1、200μg·L-1浓度下,此时上述基因的mRNA表达量分别为相应对照组的1.84倍、2.35倍、1.75倍、1.56倍,2.23倍、2.57倍,3.42倍、2.59倍、2.03倍以及123.26倍、3.01倍：精巢LHR、StAR、3β-HSD、ARa基因和垂体LHβ基因的mRNA表达量被显著(p<0.05)抑制,最小抑制值分别出现在20μg·L-1、200μg·L-1、200 μg·L-1、200μg·L-1和200μg·L-1浓度下,此时上述基因的mRNA表达量分别为相应对照组的0.46倍、0.42倍、0.39倍、0.38倍和0.42倍。而下丘脑CYP19a基因、精巢ERβ基因以及肝脏ARα、ERβ基因的mRNA表达量与对照组相比没有发生显著变化(p>0.05)。研究认为,灭多威能够对雄罗非鱼HPG轴的多个位点产生干扰作用,从而诱导血液性激素、VTG水平及性体指数发生改变,发挥其对雄罗非鱼的生殖内分泌干扰效应。灭多威对雄罗非鱼血清、肝脏和肾脏抗氧化防御系统影响的研究结果表明,在0.2μg·L-1低浓度条件下,罗非鱼血清、肝脏和肾脏SOD、CAT、GST、GR、GPx活性和GSH、GSSG含量都没有发生显著(p>0.05)变化,因此从抗氧化防御系统的角度分析,0.2 μg·L-1可以作为灭多威对雄罗非鱼无氧化损伤作用的参考阈值。在2 μg·L-1、20μg·L-1、200μg·L-1三个暴露浓度下,灭多威能够对罗非鱼肝脏、肾脏和血液抗氧化防御参数产生显著影响,并呈现出时间-效应和剂量-效应关系。从不同组织器官的抗氧化参数对灭多威的响应情况看,灭多威对雄罗非鱼肝脏、肾脏和血清抗氧化参数影响的时间-效应和剂量-效应关系的变化趋势基本一致；由于血清的采集和处理都相对方便,因此可以用血清抗氧化因子活性或含量的变化反映灭多威对鱼类肝脏或肾脏的损伤程度。然而,在同一剂量下,抗氧化参数显著升高或显著降低的时间点因组织器官不同而有所差异,显示出肝脏、肾脏和血清抗氧化参数受灭多威影响的程度不同。同时,从各个抗氧化参数的变化趋势来看,血清、肾脏和肝脏GPx和GSSG在2μg·L-1、 20μg·L-1、20μg·L-1三个暴露浓度下均被诱导;血清、肾脏和肝脏GSH在2μg·L-1 20μg·L-1、200μg·L-1三个暴露浓度下均被抑制;血清、肾脏和肝脏CAT、SOD、GST、GR的变化趋势则因灭多威浓度和暴露时间不同而有差异,在2 μg·L-1浓度下均被诱导,在20μg·L-1和200 μg·L-1浓度下,随着暴露时间的延长表现为先被诱导后被抑制的变化趋势。由于机体抗氧化参数活性或含量的变化表示机体内活性氧的大量增加,并已扰乱机体抗氧化防御系统的正常功能,因此本试验中CAT、SOD、GST、GR、GPx、GSH和GSSG等抗氧化参数的显著变化表明浓度高于2 μg·L-1的灭多威暴露能够对雄罗非鱼的抗氧化防御系统产生显著的氧化损伤。恢复试验研究显示,当暴露在各浓度组的雄罗非鱼被转移到不含灭多威的清水中恢复18d后,2μg·L-1和20μg.L-1恢复组的血清、肾脏、肝脏抗氧化参数的活性或含量(20μg.L-1复组的肝脏SOD除外)以及血清性激素、VTG含量和HPG轴性激素相关基因mRNA表达量同对照组相比均无显著差异(p>0.05),都能恢复到正常水平;而200μg·L-1恢复组的所有上述参数(肝脏CAT以及下丘脑ERβ mRNA表达量除外)同对照组相比仍差异显著(p<0.05)。因此本研究认为,浓度不高于20μg·L-1的灭多威对雄罗非鱼产生的氧化损伤和生殖功能障碍具有可逆性,而浓度不低于200 μg·L-1的灭多威对雄罗非鱼产生的氧化损伤和生殖功能障碍在18d内不具有可逆性,200μg·L-1可以作为灭多威对罗非鱼引起不可逆氧化损伤和生殖功能障碍的参考阂值。本研究表明,灭多威对罗非鱼是极高毒农药,容易导致鱼类急性中毒死亡;0.2u g·L-1可以作为灭多威对雄罗非鱼无氧化损伤作用的参考阈值,浓度高于2μg·L-1的灭多威能够对雄罗非鱼机体抗氧化防御系统产生显著的氧化损伤;2 μg·L-1可以作为灭多威对雄罗非鱼无雌激素效应的参考阈值,浓度高于20 μ g·L-1的灭多威能够对雄罗非鱼HPG轴的多个位点产生干扰作用,从而诱导血液性激素、VTG水平及性体指数发生改变,发挥其对雄罗非鱼的生殖内分泌干扰效应;雄罗非鱼性类固醇激素、VTG和GSI对灭多威的敏感性表现为：VTG>E2> 11-KT> T>GSI,显示出VTG是指示灭多威雌激素效应的敏感指标;浓度不高于20 μ g·L-1的灭多威对雄罗非鱼产生的氧化损伤和生殖功能障碍具有可逆性,而浓度不低于200μ g·L-1的灭多威对雄罗非鱼产生的氧化损伤和生殖功能障碍在18d内不具有可逆性,200 μ g·L-1可以作为灭多威对罗非鱼引起不可逆氧化损伤和生殖功能障碍的参考阈值。