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第一部分:青霉素扩环酶是实现酶法转化青霉素生产各种半合成头孢菌素的关键前体7-ADCA的关键酶。获得对青霉素G具有高催化能力的扩环酶突变体,是将其引入工业化生产需要解决的关键问题。本实验室利用定点突变和靶向突变的方法对来源于棒状链霉菌的青霉素扩环酶进行改造,以达到对青霉素G的转化活性提高的目的,从而更好的应用于7-ADCA的合成。突变位点的选择是在分析酶与底物青霉素G复合物晶体结构的基础上,先使用RasWin观察所选择残基与底物及附近残基的相互作用,根据其性质和空间大小选择可能的突变,然后再使用Swiss PDB Viewer的侧链构象搜索工具进行突变体构象的模拟。从底物结合口袋中选择了11个位点并设计了有利的突变倾向,将其中8个组合为4个组合突变库,另外3个位点采用定点突变研究。我们利用抑菌圈生物活性测定方法以及HPLC检测青霉素扩环酶对青霉素G转化率的方法,从中筛选到Y184A、S261A、S261M、R72T73、V72T73、T72T73六株生物活性提高的突变株。第二部分:来源于产黄头孢(Acremonium chrysogenum)的扩环/羟化双功能酶(acDAOC/DACS)可催化底物青霉素N扩环生成脱乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)和进一步羟化生成脱乙酰头孢菌素C(DAC)。对位于底物进出口通道处的R308位点氨基酸残基进行饱和突变,从中筛选得到了R308I、R308L、R308T和R308V四种活性得到提高的突变体,结构分析发现,将R308突变为带有短的疏水侧链的氨基酸时,降低了底物进出口通道的极性,从而使得突变体针对带有疏水侧链的青霉素底物(如青霉素G)的活性得到了明显提高。本实验的主要是对从acDAOCS的R308位点饱和突变体中筛选得到的生物活性提高较大的R308I、R308L突变体进行了动力学参数的测定,其kcat/Km值相对于野生型分别提高了2.59和3.75倍。