研究背景和目的肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是威胁我国大陆和台湾居民健康的一种常见恶性肿瘤,多年以来在研究者在肝癌的早期治疗、复发控制和转移预判机制等领域的研究取得了许多成就。然而目前除早期小肝癌(直径小于等于3cm)切除后5年生存率较高外,其他的肝癌患者5年生存率均较低,因为转移和术后复发仍是威胁肝癌患者的最主要原因。因此,寻找出能够有效针对肝癌复发和转移的干预靶点是肝癌临床研究和实验研究的最主要目的。近年来ezrin成了肿瘤转移基础研究领域中的热点。Ezrin蛋白是位于6q25的编码基因Vil2的产物,作为鸡的肠上皮纤毛的细胞骨架主要成分于20年前被Bretscher发现。研究发现Ezrin和Radixin以及Moesin是功能和结构联系非常紧密的一组蛋白质,称之为ERM家族。Ezrin富集于诸如微绒毛和细胞膜褶皱样的细胞表面结构,它将细胞骨架与细胞膜连接在一起,ezrin被认为是胞浆膜分子如CD44、ICAM-2和细胞骨架内微管、微丝的组织者和连接者。有研究表明ezrin在一些小儿恶性肿瘤如横纹肌肉瘤、骨肉瘤的转移过程中起了重要作用。现有越来越多的临床和实验证据表明ezrin分子和某些细胞粘附分子是与细胞粘附能力和癌细胞侵袭、转移过程相关的重要分子,但是我们对其在肝癌侵袭和转移中所起的作用知之甚少。复旦大学肝癌研究所在汤钊猷院士指导下建立了一种人高转移性肝癌细胞株MHCC97-H,有研究表明在体外培养的MHCC97-H中有着ezrin的高表达。有研究表明ezrin在人体肺癌、胰腺癌、子宫内膜癌中有高表达,在人体肝癌组织中有高表达,但在肝癌转移灶中表达情况不明,需要相关实验证实。紫杉醇是一种临床常用的化疗药,它作用于细胞的微管蛋白并使癌细胞的有丝分裂停滞以及诱导凋亡来抑制肿瘤生长。紫杉醇在乳腺癌、胰腺癌及肺癌等恶性肿瘤的治疗中使用较多,但是在肝癌的治疗上应用报道较少。近两年有国内外研究人员零星报道了紫杉醇能抑制肝癌细胞生长和侵袭能力。鉴于此,我们设想：既然紫杉醇是通过作用于微管系统来抑制肿瘤细胞分裂,微管系统是细胞骨架的一部分,而ezrin又被证实是细胞骨架与细胞膜分子的连接者,那么：将紫杉醇作用于肝癌细胞后其ezrin水平又会有什么变化?后者表达水平的变化会不会对肝癌细胞的运动及侵袭能力产生影响?研究方法1. 利用免疫组化及Western blot研究人体肝癌组织及转移癌中ezrin的表达的情况。2. 利用电镜技术、MTT法、流式细胞术检测、免疫细胞化学、RT-PCR及Western blot研究不同浓度紫杉醇对肝癌细胞的形态、细胞周期、生长曲线影响及ezrin表达水平的变化。3. 构建ezrin过表达载体并转染肝癌细胞后,利用划痕愈合实验、Ttanswell Assay、琼脂糖集落形成实验和裸鼠尾静脉癌细胞注射肺成瘤实验检测紫杉醇作用于前后,肝癌细胞运动和侵袭能力的变化。研究结果1. ezrin在人肝癌组织中有高表达,在转移灶中的表达强于原发灶中的表达。肿瘤越大、肿瘤分期越低、有转移灶、分化程度越低的肿瘤中往往有着ezrin高表达。2. 不同浓度的紫杉醇作用于MHCC97-H后,肝癌细胞周期改变及形态变化观察结果。2.1紫杉醇浓度在20mg/L时G2-M期细胞在整个细胞群中所占的比例为15.8%,细胞对照组为15.4%。但是S期细胞显著增加(57.2%vs29.6%)、凋亡细胞有所增加(4.4%vs2.9%)。2.2紫杉醇浓度在40mg/L时G2-M期细胞上升至40.2%,与细胞对照组(15.4%)有显著差别。2.3紫杉醇浓度到达80mg/L时,有46.3%的细胞处于G2-M期。2.4高浓度的紫杉醇作用于肝癌细胞后凋亡细胞数量较低浓度的有所增多。2.5MHCC97-H细胞与20mg/L紫杉醇共培养24h后体积增大,细胞表面可见伪足样突起的数量减少,细胞器略肿胀。2.6与MHCC97-H细胞40mg/L紫杉醇共培养24h后线粒体及高尔基氏体肿胀明显,细胞核膜皱缩,染色质向核膜边缘聚集,可见凋亡小体[14]。2.7 MHCC97-H部分细胞与80mg/L紫杉醇共培养24h后细胞表面基本看不到有伪足,细胞核大,细胞浆少,细胞处于死亡前期。2.8MHCC97-H在紫杉醇不同浓度(20/40/80mg/L)、不同时间(12h/24h/48h)作用后,以MTT比色法观察MHCC97-H生长抑制结果：作用相同时间,随着紫杉醇浓度的增加,肝癌细胞的生长抑制率逐渐升高,组间比较差异显著(P<0.05)；在同一浓度的药物作用下,随着时间的延长,MHCC97-H细胞抑制率显著增加,组间比较差异显著(P<0.05)。3.不同浓度的紫杉醇作用于MHCC97-H后,在不同层面检测肝癌细胞中ezrin表达水平的变化结果。3.1免疫细胞化学结果：ezrin在正常培养48小时后的MHCC97-H细胞中有着高水平表达,其中强阳性表达(++)细胞数>50%。而ezrin在药物处理组中的表达不同程度减弱,且在同时限下,紫杉醇浓度越高,ezrin表达越弱。20mg/L组中ezrin强阳性表达(++)细胞数<30%；ezrin在80mg/L组细胞中的表达最弱,阳性表达(+)细胞数<20%; ezrin在40mg/L组紫杉醇处理细胞中表达水平介于其他两组之间[15]。3.2 Western blot结果：统计药物处理组和细胞对照组的蛋白表达条带的灰度扫描值,结果以均数±标准差表示。将看家基因GAPDH表达的相对灰度值定为10,由此得到四组肝癌细胞中的ezrin平均相对表达量为：a组4.05±0.36(n=5)；b组3.65±0.27(n=5)；c组2.38±0.25(n=5)；d组1.66±0.19(n=5)[15]。3.3 RT-PCR结果：计算方法同上,四组肝癌细胞中的ezrin-mRNA表达的平均光密度值分别为：细胞对照组8.16±0.58(n=5)；药物处理a组7.12±0.32(n=5)；药物处理b组3.26±0.17(n=5)；药物处理c组2.99±0.21(n=5)。4.成功构建野生型ezrin过表达载体PCDNA-WT-ezrin并稳定转染细胞,体外和体内实验检测四组肝癌细胞运动和侵袭能力的变化结果。4.1 Wound scratch assay结果：未加药转染组细胞在约24小时即将5mm划痕重新覆盖。未加药未转染组细胞在无血清培养24小时后尚有近1mm的划痕未被细胞覆盖。40mg/L的紫杉醇处理组转染细胞在6小时后没见明显迁徙,12小时后有了初步的划痕修复,24小时后仍有近3.5mm的划痕未被修复。而经40mg/L紫杉醇处理组的未转染细胞在继续生长24小时后没有明显修复。4.2 Transwell asssay结果：未加药的转染组平均穿膜细胞数为42.5±3.8个；未加药的未转染组35.2±3.2个；40mg/L紫杉醇转染组27.9±2.4个；40mg/L紫杉醇未转染组12.4±1.1个。4.3软琼脂集落形成实验：未加药转染组形成集落最多,加药未转染组形成集落最少。4.4尾静脉注射形成肺转移灶结果(n=10)：未加药的转染组平均12.2±2.6个,未加药的未转染组平均10.7±2.2个,40mg/L紫杉醇处理转染组平均6.5±1.9个,40mg/L紫杉醇处理未转染组平均3.1±1.2个。结论1、ezrin在人肝癌组织中有中等强度表达,在转移灶中有高表达。ezrin的高表达与肿瘤大小、肿瘤分期、有无转移灶、肿瘤分化程度等临床病理特征相关。ezrin在切除肝癌组织中的表达水平可以作为预测人肝癌术后复发与转移的独立的因子。2、 在一定浓度范围内,随着紫杉醇浓度的增加,G2-M期细胞比例增加,凋亡细胞比例增加。紫杉醇可以引起肝癌细胞一系列超微结构改变。3、 在一定浓度范围内,紫杉醇可以下调肝癌细胞eznn表达水平,紫杉醇浓度越大,MHCC97-H细胞中ezrin表达越少。4、 紫杉醇可以通过下调ezrin表达而抑制体外培养的MHCC97-H细胞的侧向运动、纵向运动和体外成瘤能力以及减少肝癌细胞在裸鼠肺脏形成转移瘤的数量。5、 上调ezrin表达可以增强肝癌细胞的体外成瘤能力和肝癌细胞在裸鼠肺形成转移瘤能力。6、 紫杉醇可能通过抑制ezrin的表达来削弱肝癌细胞的增殖、运动、变形和侵袭能力,提示ezrin是肝癌转移的重要分子靶点。紫杉醇是抑制肝癌细胞增殖、侵袭和转移的有效药物。