集胞藻PCC 6803中橄榄酸代谢途径的构建及优化

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现代社会的高速发展导致环境污染和能源匮乏的问题日益严重,不断加剧的温室效应使得资源化利用大气中二氧化碳的研究成为热点。蓝藻光合细胞工厂的应用引起了人们的广泛关注,蓝藻生长过程中所吸收的二氧化碳在太阳能的驱动下合成出高价值的天然产物,既带来了经济效益又缓解了环境污染。橄榄酸是一种由III型聚酮合成酶催化而成的植物次生代谢物,也是合成大麻二酚这类重要化合物的一个中心中间体。当前,人们主要通过化学合成或者植物提取的方法来获取橄榄酸,这些方法不但耗时耗力,还会造成环境污染。为了降低生产橄榄酸的成本,缓解环境压力,本研究依据集胞藻PCC 6803的密码子偏好性,优化来源于大麻根毛状体中的橄榄酸合成酶基因(TKS),橄榄酸环化酶基因(OAC)和己酰-Co A合成酶基因(AAE1)的密码子。以集胞藻PCC 6803作为底盘,采用同源重组的方式实现这些基因在蓝藻细胞中的异源表达,随后使用基因组PCR扩增鉴定和RT-qPCR方法检验TKS,OAC和AAE1基因的表达,构建了合成橄榄酸的新型蓝藻细胞工厂。为了提高蓝藻合成橄榄酸的产量,我们分析蓝藻自身的代谢网络后,对其进行了优化。以下是具体的研究内容和结果:(1)橄榄酸代谢途径的构建:采用集胞藻PCC 6803作为底盘细胞,通过基因工程技术手段将橄榄酸合成的两个关键基因(橄榄酸合成酶基因与橄榄酸环化酶基因)以及己酰-Co A合成酶基因整合到基因组中,并利用光强启动子Ppsb A2s驱动目的基因表达,以获得合成橄榄酸的第一代突变株SCY02。在添加己酸钠的BG11培养基营养条件下,比较分析了突变株SCY02与野生型集胞藻PCC 6803的生长特征,采用实时荧光定量PCR鉴定突变株SCY02细胞内TKS、OAC、AAE1三个基因的表达水平,利用高效液相色谱法检测合成产物橄榄酸的产量。进一步采用Pcpc560作为橄榄酸合成基因的启动子,构建了合成橄榄酸的第二代突变株SCY03。相比第一代突变株SCY02,第二代突变株SCY03细胞内TKS、OAC、AAE1等基因具有较高的表达水平与橄榄酸产量。(2)蓝藻橄榄酸代谢途径的优化:在第二代突变株SCY03的基础上,进一步敲除蓝藻自身糖原合成代谢通路中的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(编码slr1176),同时将来自大肠杆菌中的NADP依赖型苹果酸酶基因(mae B)插入到原本ADP-葡萄糖焦磷酸化酶所在的基因位点。由于mae B基因的表达对蓝藻的三羧酸循环形成部分干预,促使其中部分的碳通量流入橄榄酸合成的代谢通路,从而促进橄榄酸产量的增长,进而构建出本研究中生产橄榄酸的最佳突变株SCY05。(3)优化工程蓝藻的培养条件:调节工程蓝藻培养基中的己酸钠浓度至8m M,加速SCY05藻株生物量的积累,缩短其生长周期,实现外源基因的高效表达,橄榄酸的产量得到提高。再以二氧化碳与空气的比例为1:19(5%CO2,95%空气)对突变株蓝藻SCY05进行持续曝气,大幅提高了蓝藻的生长量,同时将橄榄酸的产量推向了最高9.41±0.35mg/L。
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