人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)是一种双链DNA病毒,基因组约为235kb。HCMV感染是全球重要的公共卫生问题,全球范围内一般人群的血清HCMV特异性免疫球蛋白G(lgG)阳性率高达83%,育龄妇女和血液或器官的捐赠者的HCMV血清阳性率高达86%。HCMV在免疫功能低下人群(如血液病患者、HIV感染者、肿瘤及器官移植受者等)可引起较严重的感染和器官衰竭症状,甚至危及生命。目前,HCMV预防性疫苗尚未研制成功,临床上主要使用抗病毒药物对抗病毒感染。然而,目前使用的药物如更昔洛韦(Ganciclovir)、西多福韦(Cidofovir)和膦甲酸(Foscavir)等存在抗病毒效果不理想、副作用较大和耐药性等问题,不能满足临床需求,亟需开展新型防治方法研究。高效和可高通量检测的HCMV体外感染模型是支持相关新药研发的重要条件。本研究拟在已有基础上通过体系探索构建适用于新型抗病毒药物筛选与评价的HCMV可视化细胞感染模型,并初步应用于潜在抗病毒药物的评价,为进一步开展新型HCMV防治方法与药物研究提供基础。本研究应用携带报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的重组病毒HCMV-GFP-SVH构建可视化细胞感染模型。本研究建立了HCMV-GFP-SVH的培养与制备鉴定方法,建立了优化的病毒滴度检测方法,获得了可稳定支持和满足相关评价实验需要的重组病毒。人成纤维细胞是HCMV感染的重要靶细胞,本研究分别对HCMV-GFP-SVH对3种人成纤维细胞(人包皮成纤维细胞HFF、人胚肺成纤维细胞MCR-5和人皮肤成纤维细胞BJ)的感染动力学和易感性进行了分析比较。研究结果显示,HFF、MRC-5和BJ细胞均对HCMV-GFP-SVH易感,其中MRC-5相对更为易感,具有更高的病毒DNA复制水平和子代病毒效价。结果也显示,HCMV-GFP-SVH对所使用的3种人成纤维细胞在感染后的72小时内细胞形态未见显著异常,在培养上清与胞内可检测到病毒DNA复制水平和子代病毒滴度随感染时间的增加而逐步增长,至感染后3至5天,细胞逐步出现较显著的病变效应。为构建可适用于高通量和高效检测需要的HCMV体外检测体系,本研究对重要检测指标的检测方法进行体系优化。基于磁珠快速提取技术和自动化工作站,本研究优化建立了可适用于96孔培养板的HCMV病毒核酸的快速提取方法,可高效和快速地批量提取在96孔培养板中的感染细胞样品内的病毒核酸。本研究也通过比较和优化建立了具有较高灵敏度的HCMV DNA的荧光定量PCR检测方法。通过结合应用荧光快速观察检测、高通量磁珠提取法和荧光定量PCR检测法,本研究建立了可实现多指标监测和高通量检测的HCMV可视化细胞感染模型。本研究应用该模型初步开展了新型抗HCMV药物的评价研究。老药新用目前是一种重要的药物研发策略,将已获批上市药物拓展适应症具有开发效率高的优势。恩替卡韦(ETV)是一种较常用的核苷类似物抗病毒药物,已被广泛用于慢性乙肝治疗,效果较好。本研究应用建立的HCMV可视化感染模型分析了ETV对HCMV感染的潜在抑制性能。结果显示,与现有的抗HCMV药物GCV相比,ETV也可有效抑制HCMV对3种人成纤维细胞的感染,可有效抑制病毒核酸复制和子代病毒产生水平,具有良好的抗HCMV性能。综上所述,本研究构建了适用于高通量开展新型抗病毒药物筛选与评价的HCMV可视化细胞感染模型,并初步应用于潜在抗病毒药物的评价,应用该方法也初步确认了ETV具有良好的抗HCMV体外感染人成纤维细胞的能力,具有良好的抗HCMV药物发展潜能。本研究结果可为进一步开展抗HCMV的新型药物与治疗方法研究提供基础。