第一部分不同剂量维生素A补充对VAD的ASD儿童维生素A营养、OXT水平及核心症状的作用目的:孤独症谱系障碍(autism spectrum disorders,ASD)是一组神经发育障碍疾病,以重复刻板行为和社交功能受损为两大核心症状,是目前全球患病人数增长最快的严重疾病之一。ASD儿童常伴发各种共患病,影响康复及生活质量,其中营养素缺乏是儿童ASD较常见的共患疾病,营养补充治疗已被用于纠正ASD患者的营养素缺乏,并有研究发现通过某些营养素补充(叶酸、维生素B、维生素D等)可能改善ASD核心症状。维生素A(vitamin A,VA)补充对ASD症状改善作用尚不明确,已有研究报道ASD儿童维生素A缺乏率高发,采用世界卫生组织(world health organization,WHO)推荐剂量补充VA(vitamin A supplement,VAS)可一定程度改善ASD儿童VA水平,而对ASD症状未见明显改善作用。本研究首次对ASD儿童采用持续低剂量VA补充方法,并与WHO推荐的一次性高剂量VA补充方案对比,探讨不同维生素A补充剂量对ASD儿童的维生素A营养改善效果,探索适宜ASD儿童的VA补充方案。此外,通过分析ASD儿童VAS前后ASD症状量表、ASD相关分子CD38、催产素(oxytocin,OXT)变化情况及相关性分析,进一步探讨VAS是否可能是改善ASD儿童核心症状的治疗方法之一。方法:(1)纳入对象:通过整群抽样方法纳入康复机构在训的138名ASD儿童(118名男性,20名女性),年龄3-8岁,所有ASD儿童均根据精神障碍诊断和统计手册(diagnostic and statistical manual of mental disorder,DSM-V)诊断标准由专业发育行为儿科医师确诊。(2)基线调查:包括所有儿童体格测量及体格发育Z评分转换,完成社交反应量表(social responsiveness scale,SRS)、孤独症行为量表(Autism behavior checklist,ABC)、儿童孤独症评估量表(Childhood autism rating scale,CARS)以综合评估入组ASD儿童孤独症症状及严重程度。(3)血液生化指标测量:采取外周静脉血2mL,分离血清及血细胞,采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测血清视黄醇浓度(VA)、酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测血清OXT浓度;提取外周血单核细胞(PBMC)中总RNA,逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测视黄酸受体(RARs,包括RARα、RARβ、RARγ三个亚型受体)及CD38基因的相对mRNA表达量。(4)维生素A补充:入组儿童根据VA水平分为维生素A水平正常(vitamin A normal,VAN,血清VA大于等于1.05μmol/L)、维生素A不足组(vitamin A deficiency,VAD,血清VA小于1.05μmol/L),采用随机分组将VAD儿童分为VAD-1、VAD-2组,接受不同剂量的维生素A补充(vitamin A supplement,VAS)。共56名VAN的ASD儿童接受康复机构行为治疗。46名VAD-1组ASD儿童在行为治疗基础上一次性口服20万单位维生素A补充剂治疗(VAD-VAS1)。36名VAD-2组ASD儿童使用持续低剂量维生素A(平均3022单位/天)补充方案(VAD-VAS2)口服补充6个月。6个月后重新评估138名ASD患者体格发育指标、ASD症状评定量表,血清VA、OXT浓度,以及RARs,CD38 mRNA表达水平。(5)统计分析:采用配对t检验对各组儿童干预前后相关指标变化进行统计学分析,并将所有入组儿童干预前后VA变化水平与其他检测指标变化水平进行Pearson相关分析。结果:(1)两种VAS方案均可显著改善VAD的ASD儿童血清VA水平(VAS1:P=0.0061;VAS2:P<0.0001)。采用VAD-VAS1治疗的儿童血清VA浓度恢复至正常水平(1.05μmol/L以上)的比例为21/46(45.7%)。VAD-VAS2治疗的儿童血清VA恢复至正常水平的比例为23/36(63.9%),两种VAS方案恢复比例没有统计学差异(χ~2=2.701,P=0.100)。(2)VAD-VAS2方案可显著增加ASD儿童血清OXT(P=0.0027)水平,降低SRS(P=0.0162)总得分,以及PBMC中RARβ(P=0.0295)、CD38(P=0.0272)mRNA表达水平。VAD-VAS1方案对血清OXT水平、SRS得分及PBMC相关基因mRNA表达水平无显著改变。两种补充方案对ABC、CARS量表分均无显著作用。(3)VA变化水平与OXT变化程度(P<0.0001,r=0.3735)呈显著正相关。VA变化程度与SRS量表评分变化程度呈负相关(P=0.0026,r=-0.2615)。而VA变化水平与CARS、ABC量表评分变化之间未观察到显著相关性。结论:两种VAS方案均可显著改善伴有VAD的ASD儿童VA水平,此外,持续低剂量VAS可增强RARβ、CD38 mRNA表达水平。持续低剂量VAS可改善ASD儿童CD38、OXT水平和社交功能,有望成为改善ASD儿童VA水平及核心症状的治疗方法,但需要更多大样本随机对照临床研究证实。VAS可能通过RARβ增加下游CD38、OXT水平从而改善ASD社交功能,具体机制有待进一步研究。第二部分大鼠下丘脑RARβ信号改变对CD38、OXT调控作用以及对独症样行为的影响及机制研究目的:本研究第一部分发现持续低剂量补充VA可同时改善ASD儿童的VA水平及社交功能,并检测到血清OXT水平增高,外周血RARβ及CD38基因m RNA表达显著上升,提示RARβ可能通过调节CD38、OXT水平,发挥VAS对ASD社交功能改善作用的关键因子。RA-RARs信号通路在脑发育过程中发挥重要作用,RA信号通路异常可能与ASD发病相关,前期研究发现RARβ可能是大鼠CD38、OXT基因的转录调节因子。而RARβ在下丘脑(OXT生成的脑区)的功能尚不能明确,RA-RARβ信号通路对CD38及OXT基因的具体调节机制有待进一步明确。因此,为探索RARβ对CD38、OXT的调控作用及对ASD症状的影响,本部分研究通过定位改变大鼠下丘脑RARβ表达信号,检测不同RARβ信号对ASD相关分子(CD38、OXT)及大鼠孤独症样行为的影响,进一步通过体外试验验证RARβ作为转录因子对CD38基因及OXT基因的转录调控机制。方法:(1)体内研究:选取2周龄SD大鼠,采用大鼠脑立体定位注射系统将包含干扰RARβ或过表达RARβ载体的腺相关病毒(adenoassociated virus,AAV)注射至大鼠下丘脑,同一窝出生幼鼠随机分为空白对照组(Control)、PBS注射组(PBS)、过表达AAV空载病毒组(CON-RARβ)、过表达RARβ-AAV注射组(AAV-RARβ)、干扰AAV空载病毒组(CON-si-RARβ)、干扰RARβ-AAV注射组(si-RARβ)共计6组进行对应溶剂或病毒注射,持续干扰大鼠体内下丘脑RARβ信号。将处理后的大鼠饲养至8周龄,采用ANYmaze动物行为学视频分析系统,包括嗅觉测试,三厢社交测试和旷场测试,评估各组大鼠的孤独症样行为。完成行为学测试后,收集大鼠血液、脑组织标本。HPLC方法检测大鼠血清VA浓度、ELISA方法检测OXT浓度,Western Blot方法检测大鼠下丘脑RARβ、CD38蛋白表达。(2)体外研究:选取胎龄17-18天胎鼠,提取胎鼠下丘脑组织中原代神经元进行体外培养,培养至第5天采用1μmol/L全反式视黄酸(at RA)干预,24小时后提取神经元细胞蛋白及总RNA进行后续检测。Western Blot方法检测下丘脑原代神经元RARs(RARα、RARβ、RARγ)及CD38蛋白表达量,RT-PCR方法检测下丘脑神经元RARs(RARα、RARβ、RARγ)及CD38、OXT、OXTR m RNA表达情况,染色质免疫共沉淀方法(chromatinimmunoprecipitation,Ch IP-q PCR)及双荧光素酶报告基因检测(dualluciferase reporter assay)验证RARβ转录因子对CD38、OXT基因的转录调控活性及结合区域。结果:(1)定位注射RARβ干扰病毒大鼠下丘脑RARβ(P=0.0091)、CD38(P<0.0001)蛋白表达水平及血清OXT(P=0.0004)水平显著低于对照组;注射过表达RARβ病毒对下丘脑RARβ、CD38蛋白表达及血清OXT水平无显著改变,下丘脑RARβ信号降低或增加后对大鼠血清VA水平无显著影响。(2)注射si-RARβ大鼠嗅社交类气体次数显著降低(P=0.0463);三厢测试中与陌生鼠的互动时间少于对照组(P=0.1892),与玩具的互动时间长于对照组(P=0.1304),但无统计学差异;旷场测试中梳毛时长(P=0.0031)及梳毛次数(P=0.0057)显著增加。过表达RARβ大鼠三厢社交测试中与陌生大鼠互动时长增加(P=0.0445),嗅觉测试、旷场测试行为学指标无显著变化。(3)at RA处理后下丘脑神经元RARβ(P=0.0049)、CD38(P=0.0003)、及OXT(P=0.0266)m RNA和蛋白表达水平显著增加,RARβ与CD38基因启动子区2号预测位点结合增强(P=0.0167)、与OXT基因1号预测位点结合增强(P=0.05)。双荧光素酶报告基因检测显示RARβ对CD38、OXT基因都具有转录活性。电镜检测可见经at RA干预的神经元突出囊泡分泌较对照组增多。结论:(1)下丘脑定位注射si-RARβ腺相关病毒可降低RARβ蛋白、CD38蛋白表达水平及血清OXT水平;过表达RARβ信号对CD38蛋白及血清OXT水平无明显影响,下丘脑RARβ信号降低或增加后对大鼠血清VA水平无显著影响。(2)注射si-RARβ大鼠可能有社交功能受损的症状,主要体现在对社交类气体的嗅觉探索功能受损,并伴有重复刻板行为。过表达AAV-RARβ的大鼠与陌生同类大鼠互动时间增加,其余行为学未观察到明显改变。(3)at RA可显著增加下丘脑神经元RARβ、CD38、OXT基因m RNA和蛋白表达水平,RARβ对CD38、OXT基因都具有转录活性,RARβ对OXT的转录调控可能增加OXT蛋白合成、RARβ对CD38的转录调控可能间接促进OXT释放,使OXT合成、释放体系得到双重改善。