第一章：水蛭素通过调节p38MAPK与ERK通路间的交汇作用促进大鼠缺血皮瓣血管生成背景：随意皮瓣在整形外科或创伤外科常常被用于修复创伤、功能重建或改善外观。当其长宽比例过大,皮瓣远端将会有可能发生血运循环障碍,最终可导致皮瓣部分坏死。我们前期研究发现局部注射水蛭素治疗能通过有效的促进缺血皮瓣组织中的微血管生成,从而增加皮瓣最终成活面积。但水蛭素是如何促进皮瓣微血管生成的相关分子机制却未能进一步阐明。目的：在这部分研究中,我们将探讨水蛭素是否同过调解血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)和血小板反应蛋白1(Thrombospondin-1,TSP-1)与内皮抑素(Endostatin)之间表达的平衡促进皮瓣微循环的重建。此外,我们同时研究水蛭素促皮瓣微循环重建是否与调控丝裂原激活蛋白激酶类(Mitogen-activated protein kinases, MAPKs)通路激活有关。方法：在每只SD大鼠的背部中线两侧分别构建1个大小为7.5cm×1.5cm的缺血皮瓣模型。将皮瓣随机分为水蛭素组和对照组,水蛭素组皮瓣在皮下注射2 ATU水蛭素,而对照组则注射等量的生理盐水。治疗的时间为在术后即刻以及在术后第1、2和3天。术后第6天拍摄皮瓣的影像并计算皮瓣的成活面积和坏死面积。分别在术后0、1、2、4和6天提取皮瓣组织的总蛋白分进行免疫印迹分析。我们同时还检测了术后第4天和地6天皮瓣组织中的血管密度值(microvascular density, MVD)。结果：术后的第6天,水蛭素组皮瓣成活率(90士5.8%)明显高于对照组(62士7.1%),差异有统计学意义(p<0.01)；组织学观察发现,在术后第4天,对照组皮瓣的表皮层与真皮层开始出现部分坏死,皮瓣组织较少观察到微血管。而水蛭素治疗组皮瓣可观察到早期的血管新生现象且组织坏死明显少于对照组。术后第4天,水蛭素组血管密度值明显多于对照组(31.50 ± 5.68 vs.15.90 ± 5.44 per field, p< 0.01);在术后第6天,水蛭素组血管密值度为35.90 ± 6.76 per field,而对照组因为大面积的坏死,未能观察到成功染色的血管。皮瓣在形成后凝血酶的表达在术后的6天里持续增高,水蛭素能减少术后第1、2天凝血酶的表达量(p<0.01)。在两组皮瓣中VEGF术后均呈现表达升高,但水蛭素组的VEGF表达明显高于对照组(p<0.01)。在水蛭素组,endostatin的表达在术后第1、2和4天低于对照组(p<0.05)。在水蛭素治疗组皮瓣中,TSP-1的表达在术后1至6天均有明显的降低(p<0.01)。局部应用水蛭素能减少缺血皮瓣组织中p38 MAPK的磷酸化水平,提升的ERK1/2磷酸化水平(p<0.01),凝血酶可逆转水蛭素对这两种蛋白激酶的反向调控作用。抑制皮瓣中p38 MAPK的磷酸化可减少凝血酶诱导的TSP-1表达(p<0.01),但对endostatin的表达无影响(p>0.05)。我们实验发现,当注射了p38 MAPK抑制剂3h后,可观察到皮瓣组织ERK1/2激活水平明显升高(p<0.01)。但在水蛭素诱导的ERK1/2活性被ERK1/2抑制剂抑制后,p38 MAPK的磷酸化水平并未受到影响。这一结果提示在皮瓣缺血条件下,存在着一个p38 MAPK到ERK1/2的单向通路交汇作用。PAR1抑制剂注射后能明显减少p38 MAPK的磷酸化,而增加ERK1/2磷酸化的水平(p<0.01)。这一结果与水蛭素治疗后观测到的相似。在PAR1被拮抗的情况下,水蛭素并不能进一步降低p38 MAPK的磷酸化,但仍然可以升高ERK1/2的磷酸化水平(p<0.01)。这一实验说明,ERK1/2的激活是部分来自对p38MAPK的抑制,而一部分可能与水蛭素其他作用有关。结论：我们的研究发现,水蛭素的促血管生成作用不仅是通过促进VEGF的生成,还可能包括减少血管生成抑制因子TSP-1和endostatin的释放。p38 MAPK和ERK1/2之间的通路交汇作用存在于缺血皮瓣组织中,水蛭素通过拮抗凝血酶/PAR1相关通路来调控该交汇作用,进而调控血管生成或抑制因子的表达,影响皮瓣组织血管生成的过程。第二章：缺氧条件下水蛭素对皮瓣血管内皮细胞保护作用相关机制研究背景：在我们的前期研究中,将水蛭素直接应用于活体实验,发现能有效的改善血运障碍皮瓣的血液循环,并能促进皮瓣组织内血管增殖,但我们前期的研究未能进一步的深入探讨水蛭素对血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs)的影响。目的：研究水蛭素对缺氧或凝血酶诱导大鼠血管内皮细胞凋亡的影响。方法：应用CD31免疫荧光定位血管内皮细胞,在此基础上应用Tunel法检测细胞的凋亡,以此计算皮瓣中血管内皮细胞的凋亡率。从SD大鼠主动脉中分离并培养出大鼠血管内皮细胞。在细胞培养出来后,应用CD31免疫荧光和流式细胞学鉴定血管内皮细胞。实验将细胞分为正常组对照组(Nor组)、缺氧对照组(Cont组)、凝血酶组(2 U/ml凝血酶,Tho组)、水蛭素组(2ATU/ml水蛭素,Hir组)、低浓度水蛭素凝血酶组(1ATU/ml水蛭素+2/ml U凝血酶,Low-T+H组)和高浓度水蛭素凝血酶组(2ATU/ml水蛭素+2/ml U,凝血酶High-H+T组)。在细胞经受缺氧刺激后6小时,将细胞总蛋白提出,并检测Bim、ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化水平。同时,应用Tunel分析各组细胞的凋亡率。结果：在缺血皮瓣组织中,对照组血管内皮细胞凋亡率为87.24±8.34%,水蛭素组凋亡率为36.44±9.57%,两组经比较发现差异有统计学意义(p<0.01)。当培养基中含有2 U/ml凝血酶时,细胞在缺氧条件下的凋亡率显著升高(p<0.01)。应用水蛭素对抗凝血酶后,可降低凝血酶诱导的细胞凋亡(p<0.01)。缺氧可造成血管内皮细胞的p38 MAPK磷酸化水平升高(p<0.01),若这种情况下培养基中还存在有凝血酶,那么凝血酶可使得血管内皮细胞内p38 MAPK磷酸化水平进一步升高(p<0.01)。水蛭素可抑制凝血酶诱导的细胞内p38 MAPK磷酸化(p<0.01)。在20μM的SB203580抑制p38MAPK磷酸化的情况下添加2 U/ml凝血酶不能使得细胞凋亡增加。我们还发现,应用SB203580抑制p38 MAPK磷酸化后,ERK1/2的磷酸化水平与对照组(Cont组)相比得到提高(p<0.01),说明可能存在p38 MAPK和ERK1/2通路间交汇。水蛭素可降低凝血酶诱导的p38 MAPK磷酸化并促进ERK1/2的激活水平(p<0.01)。同时,我们观察到在Low-T+H组Bim的磷酸化水平明显低于凝血酶组(Tho组)(p<0.01)。结论：缺氧状态下凝血酶可进一步的刺激p38 MAPK磷酸化和抑制ERK1/2的磷酸化,增加大鼠血管内皮细胞凋亡。水蛭素主要是通过拮抗凝血酶对p38 MAPK和ERK1/2的反向激活作用,阻断凝血酶诱导血管内皮细胞的凋亡。