纳米抗体,也称为单域抗体或重链抗体可变区,是一种分子量只有常规抗体十分之一大小,但仍具备较好抗原结合能力的抗体分子。因其具有结构尺度小、生化性质稳定、易于原核表达等特点,在各类研究及应用中引起了广泛关注。为进一步拓展其应用,纳米抗体的修饰和固定化等改造至关重要。传统化学修饰方法容易使纳米抗体结构受到影响甚至失去活性,所以须采用更为可控的定点修饰技术进行改造。但现有技术存在效率较低或步骤复杂等缺陷,因此,迫切需要发展一种简便高效的定点修饰技术以满足纳米抗体的应用需求。目前,由于融合标签小,操作简便等优点,甲酰甘氨酸生成酶(Formylglycine-generating enzyme,FGE)催化的蛋白质定点醛基化修饰方法正在受到越来越多的关注。基于纳米抗体的抗原结合域临近N端,本文提出利用FGE催化对纳米抗体的C端进行定点醛基化修饰,并探索了其在一步定点固定化、构建C端-C端(C-C)连接二价抗体和以纳米抗体为单体制备功能化冰胶整体材料方面的应用,具体开展了以下四个方面的工作:(1)首先尝试了在大肠杆菌胞内共表达FGE以催化纳米抗体定点醛基化修饰,但发现纳米抗体的可溶表达和催化不能同时进行;进一步的研究发现,对于胞内可溶表达量高的蛋白A,能够通过共表达的方式实现胞内蛋白A的定点醛基化修饰。对FGE与蛋白A共表达的大肠杆菌进行大量培养,获得了含有定点醛基化修饰蛋白A的细胞破碎上清液,该上清液不经纯化,直接与酰肼功能化的交联琼脂糖微球发生反应,实现了蛋白A的一步定向醛基化固载,固载特异性可达80%,该方法可使亲和层析填料的制备过程大大简化。上述研究说明共表达过程中FGE的催化效果与蛋白质的种类及可溶表达程度密切相关,通用性较差,因此本文将后续研究重点转移至FGE的体外定点醛基化修饰技术。(2)进一步对FGE的体外定点醛基化修饰技术进行了系统研究。以自行筛选的抗人β2微球蛋白(hβ2M)纳米抗体sdAb-55为模式蛋白,采用Box-Behnken实验设计,对FGE体外催化条件进行优化。发现在18～37℃、20 mMNaCl、2mM巯基乙醇、3μM硫酸铜和pH 9.3的反应条件下,仅需加入纳米抗体摩尔量十分之一的FGE,催化4小时就可使纳米抗体sdAb-55达到85%左右的醛基转化率。单位FGE对纳米抗体醛基标签转化的时间产率为2.13 mol·h-l·mol-1,比文献报道提高约40倍。此外,还发现FGE在重组表达过程中,在其239位半胱氨酸位点存在自体醛基化修饰现象,该现象会干扰体外纳米抗体FGE醛基化修饰的进一步应用。本研究通过将239位半胱氨酸突变为丙氨酸的方式获得了 FGE-C239A突变体,消除了自体醛基化现象,该突变体不仅保持了原有的催化活性,还具备更好的热稳定性,为后续纳米抗体醛基化修饰的应用奠定了良好的基础。(3)基于上述建立的体外FGE高效醛基化修饰技术,首先探讨了 C-C连接二价纳米抗体的合成方法,首次利用冰晶微液相浓缩技术实现了 C-C连接二价纳米抗体的制备。该方法通过冷冻条件下的成腙或成肟反应,实现了纳米抗体C端醛基与双酰肼或双氧氨接头的偶联,解决了单个柔性链两端双功能基同时与两个生物大分子C末端醛基碰撞几率低难以同时发生化学反应的难题。研究结果表明:-10℃至-20℃的条件下,均能有效实现C-C连接二价纳米抗体的合成,特别在-10℃条件下,24小时的二价纳米抗体最高产率可达40%(常温条件下,相同制备条件产率几乎为0)。进一步以抗hβ2M的纳米抗体sdAb-55和sdAb-83为原料,研究了不同长度、不同类型的两端双功能基柔性链对C-C连接二价纳米抗体或双特异性纳米抗体亲和力的影响。结果表明,尽管C-C连接纳米抗体的功能受其结构、柔性链长度及功能基类型的影响,但对抗原的亲和力均明显优于传统C-N连接的纳米抗体。与纳米抗体单体相比,C-C连接二价纳米抗体亲和力最高提升100倍,C-C连接双特异性纳米抗体亲和力最高提升200倍。该研究为二价及多价纳米抗体的合成提供了新的有效的平台技术。(4)利用上述系列技术,进一步开展了通过纳米抗体C末端修饰技术制备功能材料的研究。以抗hβ2M纳米抗体为功能分子,利用体外FGE高效酶催化技术进行其C端醛基化修饰,并通过该醛基实现纳米抗体与氨基苯乙烯的高效偶联。利用冰晶微液相浓缩自由基聚合及冰晶制孔技术,首次实现了以苯乙烯修饰纳米抗体为单体的整体材料的制备。将苯乙烯修饰纳米抗体、丙烯酰胺和聚乙二醇二丙烯酸酯以合适的浓度混合,在-18℃条件下反应18个小时,制备了孔道尺度10～100μm、孔隙率约80%的冰胶整体材料,该材料对hβ2M吸附容量可达3.42 mg/mL gel。这一制备过程步骤简单、一步成型,适用于多种容器,采用定点偶联最大程度保留了纳米抗体活性,在制备精准血液净化吸附材料领域具有良好的应用前景,也有希望拓展到亲和层析材料制备领域。综上所述,甲酰甘氨酸生成酶催化的纳米抗体定点醛基化是一种高效、简便的定点修饰技术,在亲和配基的定点固定化,C-C连接多价纳米抗体的构建方面应用前景广阔。此外,醛基化修饰后的纳米抗体能够进一步高效的连接含有烯基的化合物,为原位聚合制备纳米抗体功能化的生物材料提供了新的途径。