【摘 要】
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肝癌是一种常见的恶性肿瘤,缺乏临床诊断的特异性生物标记物,且目前的治疗效果也不甚理想。因此,更好地了解其发病机制和早期筛查的新靶点可能会提高肝癌患者的生存率。miRNA是一类高度保守的内源性非编码的单链RNA分子,它广泛存在于生物中,其长度约为22个核苷酸。当miRNA出现异常表达时,它往往与肝癌的发生和发展有着紧密的联系,并影响耐药性。已有研究将miRNAs作为特定的生物标志物和治疗靶标进行了分
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肝癌是一种常见的恶性肿瘤,缺乏临床诊断的特异性生物标记物,且目前的治疗效果也不甚理想。因此,更好地了解其发病机制和早期筛查的新靶点可能会提高肝癌患者的生存率。miRNA是一类高度保守的内源性非编码的单链RNA分子,它广泛存在于生物中,其长度约为22个核苷酸。当miRNA出现异常表达时,它往往与肝癌的发生和发展有着紧密的联系,并影响耐药性。已有研究将miRNAs作为特定的生物标志物和治疗靶标进行了分析,证明基于miRNA的治疗方法在HCC动物模型中显示出安全性和抗肿瘤功效。因此,进一步探究miRNA在肝癌发生发展中的作用及其干预机制,对于探索肿瘤诊疗中有效的潜在靶点具有重要的科研意义和临床价值。本文以肝癌为研究对象,通过生物信息学相关方法筛选、鉴定肝癌细胞差异表达的miR-101-3p,并对其潜在靶点进行预测,采用CCK8、Western blot等实验检测和评估其对肝癌细胞恶性生物学表型的调控作用。（1）miRNA的筛选和生物信息学分析通过对TCGA数据库中肝癌全基因组miRNA-seq和mRNA-seq表达数据集的下载与整理。首先对肝癌细胞差异表达的miRNA进行筛选,采用python语言对差异表达miRNA绘制火山图,确定差异倍数;随后用R包“survival ROC v1.0.3”软件对筛选的miR-101-3p进行临床价值评估和生存曲线绘制,最终确定miR-101-3p为后续研究对象。结合TCGA数据库中肝癌全基因组mRNA-seq表达数据集,通过R包“WGCNA v1.69”软件分析筛选miR-101-3p相关的预后基因模块。利用GO和KEGG通路富集分析方法,分析miR-101-3p相关靶基因的生物学功能。其次,利用R包中的“survival v3.1-8”和“glmnet v3.0-2”两个包分别进行单因素COX回归和LASSO回归分析,从而建立多基因签名的风险预后模型,用来评估miR-101-3p对患者风险评分的预测能力和预后意义。最后将筛选预测的4个基因模块的基因、差异共表达基因、7个基因签名进行交互,筛选预测出miR-101-3p的靶基因为CDCA8,并对其进行蛋白互作网络分析以及查看CDCA8基因在肝癌中的表达情况。结果发现,肿瘤组织中miR-101-3p表达量显著下调,说明其表达水平对于患者的预后来说是具有比较好的临床预测能力。基因富集分析显示,miR-101-3p信号在肝癌细胞增殖和侵袭迁移等恶性生物学过程中起着调控作用。蛋白互作网络显示基因CDCA8与多个肝癌蛋白有互作,且CDCA8基因在肝癌中显著高表达。这些结果为后续miR-101-3p调控肝癌恶性生物学表型及抗肿瘤的干预机制研究提供理论依据和研究基础。（2）miR-101-3p对肝癌细胞恶性生物学表型的验证为验证肝癌细胞miR-101-3p的差异性表达及其在肝癌细胞恶性生物学表型调控中的作用,首先采用qPCR分别检测了HL-7702、97L、M3细胞株以及肝癌组织和癌旁正常肝组织中miR-101-3p的表达情况。其次采用miR-101-3p mimic转染肝癌细胞方法,检测它对于肝癌细胞在增殖、凋亡和迁移方面关于基因和蛋白的表达情况。最后用qPCR和Western Blot检测到CDCA8基因在肝癌组织中的表达水平是高于癌旁正常的肝组织,miR-101-3p下调了CDCA8的表达。最后通过Target Scan软件发现了miR-101-3p与CDCA8基因的结合位点,进一步验证了CDCA8基因是miR-101-3p的靶基因。综上所述,本文筛选出的肝癌细胞差异表达miR-101-3p具有良好的临床指征,对肝癌细胞的增殖、凋亡和侵袭迁移具有重要的调控作用,且miR-101-3p可降低预测的潜在靶点CDCA8基因的表达量。本文研究结果将为肝癌发生发展和干预的机制研究提供理论基础和视角参考。
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