研究背景：慢性移植物抗宿主病(Chronic graft versus host disease, cGVHD)患者60%～90%眼部受累,主要表现为干眼综合症,干燥性角结膜炎和瘢痕性结膜炎等。其中以干眼综合症最为常见,也是评价广泛性cGVHD的一项重要指标,提示疾病预后不良。干眼综合症虽然不威胁生命却严重影响患者的日常工作和生活质量,如果得不到有效的治疗,将引发眼部疼痛、角膜溃疡或瘢痕,严重者将出现视力受损、甚至失明。目前国内外对cGVHD相关的干眼症研究较少,cGVHD患者一旦出现干眼症状,干眼病情发展迅速,并且治疗手段有限,非常棘手。目前主要采用人工泪液、泪小点栓塞、全身和眼局部免疫抑制剂甚至睑缘缝合术以缓减干眼症状。尽管多种新型免疫抑制剂及单克隆抗体己在临床使用,但总体疗效仍不满意,而且还存在副作用大、疗程长、费用高等问题,并不能有效缓减cGVHD相关干眼。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)作为一种多潜能的非造血干细胞,不仅具有多向分化能力,还具有独特的免疫调节功能,是移植领域具有广泛应用前景的再生来源细胞。间充质干细胞具有低免疫原性、体外容易扩增等特点,其独特的免疫负调节作用表现在,可通过直接分泌可溶性因子(如生长因子、细胞因子、趋化因子、蛋白酶)和／或与细胞直接接触等方式,在不同层次上与几乎所有免疫细胞,包括树突状细胞(dendritic cell, DC)、NK细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞相互作用而发挥免疫调节作用。MSC全面的独特免疫调节能力使其在临床治疗cGVHD及其相关靶器官损害中具有广泛的应用前景。无论何种机制触发的cGVHD,均必须经过抗原提呈细胞(Antigen presenting cell,APC)提呈抗原→T细胞活化、增殖→T效应细胞攻击靶细胞的病理生理过程。DC作为迄今发现的功能最强的专职APC,在诱导免疫应答及免疫耐受中均可发挥重要作用,在启动和维持强化cGVHD异常的免疫应答反应中扮演着重要的角色,是cGVHD主要的免疫病理靶点。最近研究发现MSC能抑制成熟DC(mature DC, maDC)的生成、增殖、抗原呈递和迁移能力,调节DC的成熟、分化,甚至可能逆转InaDC为未成熟DC(immature DC,imDC),间接抑制DC启动的T淋巴细胞增殖,从而发挥负向免疫调控作用。这类经MSC诱导产生的新型DC又称为调节性DC(Regulatory DC, DCreg)。越来越多的研究发现DCreg与CD4+T细胞亚群在机体免疫调节过程中具有紧密的联系,DCreg可能通过分泌细胞因子或细胞直接接触影响CD4+T细胞的增殖分化。早期研究发现Thl、Th2细胞参与cGVHD的发生发展并参与介导Graft-versus-leukema/lymphoma (GVL)。但阻断Th1与Th2类因子并不能完全阻止cGVHD的发生发展,提示可能还有其他细胞亚群及其因子参与cGVHD的病理过程。近年随着免疫学的进展,研究发现CD4+T细胞在特定细胞因子及环境因素作用下还可分化为Thl7,Treg新亚群。研究者开始反思以往认为的Th1,Th2致炎性自身免疫性疾病的病生过程,发现在Thl尚未生成之前,Th17就已经增殖分化参与细胞免疫,而在Th2效应分子已经下降之后仍有Th17细胞的IL-17等促进体液免疫,因此提出Thl7才是许多人类自身免疫性疾病的关键性致病CD4+T细胞亚群。而Treg是专职调节效应细胞和诱导外周免疫耐受的Th亚群,主要维持机体自我耐受及免疫稳态。Th17细胞和Treg细胞在分化上、功能上均相互拮抗：初始T细胞在高浓度TGF-β单独作用下,可以诱导Treg细胞特异性的Foxp3转录因子高表达,促进Treg细胞分化。而在TGF-β和IL-6的共同作用下,初始T细胞则高表达Th17细胞的特异性转录因子RORyt,促使向Thl7细胞方向增殖分化。一旦Treg生成减少或者功能减弱,特别是Th17/Treg之间的平衡发生紊乱,将成为通向多种免疫性疾病和移植排斥的干线。基于以上研究,我们提出这样一个假说：MSC具有强大的免疫调节功能,可能通过诱导maDC产生新型DCreg而间接发挥作用,DCreg可形成低浓度炎性细胞因子(IL-6、IL-12)而高浓度调节性细胞因子(IL-10、TGF-β)的微环境,高浓度TGF-β可抵消IL-6、IL-12等的拮抗作用,促进Treg细胞而抑制Th17细胞的增殖分化,从而恢复Treg与Th17细胞之间的免疫平衡,减轻机体全身及眼表组织的免疫炎症损害,缓解cGVHD相关干眼的病理进展。目的：1.明确MSC治疗难治性cGVHD相关干眼的安全性和临床疗效。并进一步在cGVHD相关干眼患者中检测MSC治疗前后,DC活化的主要标记CD40,CD80,CD86等共刺激分子以及Th17、Treg细胞比例的变化,以期初步揭示MSC在cGVHD相关干眼中的免疫调控机制。2.在体外细胞水平,通过MSC与maDC共培养,以诱导分化生成的新型调节性树突状细胞DCreg为切入点,探索其与Th17、Treg细胞比例之间的关系,初步研究MSC经DCreg调控Th17和Treg平衡的免疫调节机制。方法：1.分离扩增人临床应用级骨髓MSC,经静脉输注治疗18例难治性cGVHD相关干眼患者,采用NIH cGVHD眼睛受损评价标准评价MSC治疗前后眼部受损情况,检测MSC治疗前后泪液分泌情况(Schirmer test)、泪膜破裂时间(breakup time of tear film, BUT)及应用国际眼表疾病指数(Ocular Surface Disease Index,OSDI)积分法评价干眼的严重程度；并监测MSC治疗后的不良事件。2. qRT-PCR检测难治性cGVHD相关干眼患者MSC治疗前后外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)的CD40、CD80、CD86mRNA水平。3.流式细胞术检测难治性cGVHD相关干眼患者MSC治疗前后外周血Th17、Treg细胞的比例。4.分离培养小鼠MSC和maDC,通过二者共培养后,流式细胞术检测共培养前后DC的免疫表型变化；并用ELISA法检测MSC诱导生成的DCreg与单maDC上清液中IL-6、IL-12、IL-10和TGF-β浓度。5.分别将DCreg和rnaDC与鼠脾脏淋巴细胞混合培养,MTT检测淋巴细胞增殖情况；流式细胞术检测混合淋巴细胞培养中CD4+CD25+Foxp3+(Treg)、CD4＋IL-17A(Thl7)细胞比例。结果：1.MSC治疗18例难治性cGVHD相关干眼患者,其中10例(55.55%)获得了缓解,3例为CR,7例为PR。全部患者经MSC治疗后NIH cGVHD眼睛受损评分明显下降,Schirmer test、 BUT。 OSDI均较治疗前显著改善。至末次随访,未发现异位组织发生、继发第二肿瘤及相关输注不良反应。MSC治疗难治性cGVHD相关干眼组与同期非难治性cGVHD组生存率及无复发生存率差异无显著性意义。2.MSC治疗后cGVHD并发干眼症患者PBMC中共刺激分子CD40、CD80、CD86较治疗前呈显著性下降。MSC治疗后Thl7细胞较治疗前下降而Treg细胞较治疗前升高,Th17/Treg比例治疗后呈显著性下降。3. MSC与maDC共培养后,DC共刺激分子CD40、CD80、CD86等显著下调,而高表达髓系标志CDllb；同时经MSC处理后的maDC还高表达Notch信号通路的Jagged2配体。即MSC诱导maDC生成一种新型的DCreg(简称为：Jagged2high CD11bhigh MSC-DCreg)。4. Jagged2high CD11bhigh MSC-DCreg分泌IL-6,IL-12较maDC低,而分泌IL-10、TGF-β较maDC高。5. Jagged2high CD11bhigh MSC-DCreg抑制淋巴细胞增殖,并下调Th17细胞,上调Treg细胞比例。结论：应用体外扩增骨髓MSC可有效治疗难治性cGVHD相关干眼,而且无明显相关不良反应。MSC发挥强大的免疫调节作用,其机制可能是通过诱导maDC生成具有调节功能的新型Jagged2high CD11bhigh MSC-DCreg,进而经高分泌细胞因子IL-10、TGF-β,低分泌IL-6、IL-12,恢复Th17与Treg细胞的平衡,从而促进cGVHD相关干眼患者免疫病理的恢复。