研究背景和目的重症社区获得性肺炎(severe community-acquired pneumonia, SCAP)是呼吸内科重症监护病房最常见的危重病之一,常导致全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),病情进展快,处理不及时,可发展为多器官功能障碍综合征(multiple system organ dysfunction, MODS)。急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是SCAP最常见而严重的病理生理过程,是肺部炎症致肺泡上皮细胞受损和肺微血管通透性增加而导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭,其最终阶段即为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)。传统认为,肺泡上皮细胞是肺部炎症反应的靶细胞,具有调节炎症发展及预后的能力。在细菌所致肺部急性炎症反应中,革兰阴性菌细胞壁的糖脂成分脂多糖(LPS)发挥了关键作用,LPS可以直接募集血液中性粒细胞进入肺泡进而促进细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)等的释放,通过调控炎症通路的活化以及诱导其它细胞因子和粘附分子的产生,进而造成更严重的肺部损伤。细胞凋亡是细胞在一定生理或病理条件下,遵循自身程序,自己结束生命的过程,对于机体稳定和生长发育具有重要的意义。大量研究显示,肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar typeⅡepithelial cell, AT-Ⅱ)的凋亡在肺部重症感染所致ALI中起了至关重要的作用,AT-Ⅱ细胞的过度凋亡将导致结构细胞数量减少和肺组织病理变化加重；另外在ALI病理变化过程中需将受损的AT-Ⅱ细胞清除,此过程可能引起炎性反应而加重已存在肺组织的损伤,因此肺泡上皮细胞凋亡在调节炎症对肺损伤的反应方面发挥着重要的作用。细胞凋亡是有一序列酶参与、由基因控制的一个主动的、高度有序的过程,其中Bcl-2家族成员在细胞凋亡的基因调控过程中起着十分重要的作用,根据作用不同分为两类：①抑制性亚族,如Bcl-2、Bcl-X、Mcl-1,可在多个环节上阻断细胞凋亡；②促进性亚族,如Bax、Bak、Bad、Bik、Bid等,与抑制性亚族结合而封闭其活性域。核因子-KB(nuclear factor-κB, NF-κB)是由Sen等从B淋巴细胞核提取物中发现的一种能与免疫球蛋白κ链基因增强子κB序列特异结合的核蛋白因子,因此命名为NF-κB。目前所知NF-κB家族成员包括RelA(p65)、RelB、c-Rel、p50和p52五个亚单位。通常NF-κB以p65／p50二聚体形式存在胞浆中,其中p65含有转录活化区域,在静息状态下,胞浆中的NF-κB与抑制性蛋白IκB-α结合,不能发挥转录调节作用,当细胞受到如TNF-α等细胞外信号刺激时,IκB-α被磷酸化并从NF-κB二聚体上解离下来,p65／p50二聚体立即转移入核,与其靶基因启动子／增强子上的KB位点结合,启动相关基因的转录。NF-κB信号通路参与了感染、炎症反应和肿瘤等病理过程以及细胞周期调控等,近年来研究表明,NF-κB家族及其介导的细胞信号转导在细胞凋亡中起到了重要作用,它参与了多种凋亡相关基因的转录调控,具有抑制细胞凋亡和促进细胞凋亡的双向作用。NF-κB与细胞凋亡的关系最早在肿瘤生长等方面研究,以往研究显示NF-κB可诱导细胞表达TNFR1结合因子(TFAF)和细胞凋亡蛋白抑制物,抑制caspase的级联反应,从而阻断死亡受体TNFR/Fas介导的凋亡信号转导,而抑制细胞凋亡,所以NF-κB在肿瘤中的主要作用表现为抗凋亡作用。但在SCAP中NF-κB与细胞凋亡的关系却复杂得多,是抑制凋亡还是促进凋亡?目前还有争论。一方面,在多形核中性粒细胞(PMNs)等炎症细胞,NF-κB活化使抗凋亡蛋白合成增加,而使其凋亡延迟,Kupfner J G等在内毒素引起的ARDS中发现NF-κB活化继而引起A1、A20及Bcl-X的转录增加,并引起凋亡抑制,在应用NF-κB抑制剂后PMNs的凋亡加快；另一方面,对于肺泡上皮细胞和内皮细胞等肺结构细胞,有报道认为,NF-κB调控失常使促凋亡蛋白如IL-8、TNF、FasL等的转录表达增强,引起细胞凋亡的加强,但其凋亡的调控机制还不是很清楚。鉴此,本研究拟采用重组的人细胞因子TNF-α刺激AT-Ⅱ细胞A549,探讨炎症环境下肺泡上皮细胞凋亡的基因调控机制。首先,在TNF-α刺激的不同时间点检测细胞凋亡率的变化及凋亡基因Bcl-2、Bax的表达情况,了解TNF-α对肺泡上皮细胞凋亡的影响；其次,利用Bax小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)沉默凋亡基因Bax的表达,明确Bax基因与TNF-α诱导肺泡上皮细胞凋亡的关系；最后,再利用NF-κB/p65 siRNA沉默NF-κB家族亚单位p65基因的表达,初步探讨NF-κB/p65基因在TNF-α诱导肺泡上皮细胞凋亡中的作用及可能机制。方法1、培养AT-Ⅱ细胞(来源于人肺泡上皮细胞株A549),在细胞密度为80%～90%时采用低浓度(10ng/ml)的TNF-α刺激A549细胞,分别在刺激细胞0h、6h、12h、24和48h五个时间点收集细胞,流式细胞仪(Annexin V-FITC法)检测细胞凋亡率,RT-PCR检测Bcl-2和Bax mRNA, Western blotting和免疫组化检测Bcl-2和Bax蛋白表达；2、利用脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将Bax siRNA转染入A549细胞,6h后给予TNF-α(10ng/ml)刺激24h收集细胞,实验分4组：空白对照组、TNF-α组、TNF-α+Bax siRNA组(干扰组)、TNF-α+scramble siRNA组(阴性对照组)。RT-PCR检测Bax mRNA, Western blotting和免疫组化检测Bax蛋白表达,流式细胞仪(Annexin V-FITC法)检测细胞凋亡率；3、利用脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将NF-κB/p65 siRNA转染入A549细胞,6h后给予TNF-α(10ng/ml)刺激24h收集细胞,实验分4组：空白对照组、TNF-α组、TNF-α+NF-κB/p65 siRNA组(干扰组)、TNF-α+scramble siRNA组(阴性对照组)。RT-PCR检测NF-κB/p65、Bcl-2、Bax mRNA,免疫组化检测NF-κB/p65的活化,Western blotting检测Bcl-2、Bax蛋白表达,流式细胞仪(Annexin V-FITC法)检测细胞凋亡率。结果第一部分TNF-α诱导肺泡上皮细胞凋亡及对Bcl-2和Bax的影响(1)、流式细胞仪结果显示：TNF-α0h组有少量细胞凋亡(0.09±0.05)%,6h组(4.38±0.40)%、12h组(5.31±0.17)%、24h组(5.84±0.14)%和48h组(6.37±0.32)%均明显高于TNF-α0h组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)、RT-PCR结果显示：TNF-α0h组Bcl-2 mRNA相对含量最高(0.24±0.03),6h组(0.21±0.02)高于TNF-α0h组,但差异无统计学意义(P=0.139),12h组(0.16±0.02)、24h组(0.15±0.01)和48h组(0.11±0.02)均高于TNF-α0h组,差异有统计学意义(P<0.05); TNF-α0h组Bax mRNA相对含量较低(0.15±0.03),6h组(0.26±0.05)、12h组(0.33±0.03)、24h组(0.38±0.03)和48h组(0.41±0.12)均高于TNF-α0h组,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)、Bcl-2/Bax蛋白Western blotting结果显示：胞质内Bcl-2蛋白相对含量随着时间延长表达减少,6h组(0.64±0.04)、12h组(0.63±0.03)、24h组(0.40±0.06)、48h组(0.18±0.05)均低于TNF-α0h组(0.76±0.07),差异有统计学意义(P<0.05); Bax蛋白相对含量随时间延长而表达增加,6h组(0.42±0.04)、12h组(0.59±0.03)、24h组(0.75±0.04)、48h组(0.97±0.05)均高于TNF-α0h组(0.34±0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。(4)、免疫组化结果显示：Bcl-2蛋白在TNF-α0h组即有较强的阳性表达,IOD值(9.89±0.75),6h组(4.89±0.26)、12h组(1.94±0.11)、24h组(1.44±0.06)和48h组(1.25±0.12)阳性表达均低于TNF-α0h组,差异有统计学意义(P<0.05); Bax蛋白在TNF-α0h组阳性表达较少,IOD值(1.58±0.38),6h组(6.19±0.70)、12h组(16.82±2.37)、24h组(36.04±2.45)和48h组(38.02±2.84)阳性表达均高于TNF-α0h组,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分沉默Bax基因对TNF-α诱导肺泡上皮细胞凋亡的影响(1)、RT-PCR结果显示：Bax siRNA组Bax mRNA相对含量(0.19±0.03)均低于其它三组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)、Western blotting结果显示：Bax siRNA组Bax蛋白相对含量(0.05±0.01)均低于其它三组,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)、免疫组化结果显示：Bax siRNA组胞质内Bax蛋白阳性表达(5.00±0.79)低于TNF-α组(35.15±5.33)和scramble siRNA组(39.16±4.53),差异有统计学意义(P<0.05)。(4)、流式细胞仪结果显示：Bax siRNA组细胞凋亡率(1.55±0.28)%低于TNF-α组(5.21±0.53)%和scramble siRNA组(4.84±0.47)%,差异有统计学意义(P<0.05)。第三部分沉默NF-κB/p65基因对TNF-α诱导肺泡上皮细胞凋亡的影响(1)、RT-PCR结果显示：NF-κB/p65 siRNA组NF-κB/p65 mRNA相对含量(0.04±0.01)均低于其它三组,差异有统计学意义(P<00.05); NF-κB/p65 siRNA组Bcl-2 mRNA相对含量(0.41±0.06)低于TNF-α组(0.21±0.02)和scramble siRNA组(0.17±0.03),差异有统计学意义(P<0.05)；相反NF-κB/p65 siRNA组Bax mRNA相对含量(0.10±0.03)高于TNF-α组(0.27±0.02)和scramble siRNA组(0.28±0.02),差异有统计学意义(P<0.05)。(2)、免疫组化结果显示：NF-κB/p65 siRNA组胞质内NF-κB/p65蛋白阳性表达(7.00±1.06)均低于TNF-α组(38.41±1.67)和scramble siRNA组(7.00±1.06),差异有统计学意义(P<0.05),而且TNF-α组和scramble siRNA组NF-κB/p65蛋白阳性表达主要定位于胞核。(3)、Western blotting结果显示：NF-κB/p65 siRNA组Bcl-2蛋白相对含量(0.32±0.06)高于TNF-α组(0.09±0.08)和scramble siRNA组(0.13±0.04),差异有统计学意义(P<0.05)；相反NF-κB/p65 siRNA组Bax蛋白相对含量(0.08±0.04)低于TNF-α组(1.14±0.09)和scramble siRNA组(1.11±0.10),差异有统计学意义(P<0.05)。(4)、流式细胞仪结果显示：NF-κB/p65 siRNA组细胞凋亡率(3.52±1.11)%明显低于TNF-α组(12.66±1.07)%和scramble siRNA组(12.10±1.15)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究发现：1、低浓度(10ng/ml)TNF-α通过上调凋亡相关基因Bax/Bcl-2表达比例诱导AT-Ⅱ细胞(A549)凋亡；2、Bax基因沉默能明显减少TNF-α诱导A549细胞凋亡；3、NF-κB/p65基因沉默能明显减少TNF-α诱导A549细胞凋亡,其机制可能是通过下调凋亡相关基因Bax/Bcl-2表达比例从而减少A549细胞凋亡；4、NF-κB家族亚单位p65的活化参与了肺泡上皮细胞凋亡信号转导,提示NF-κB/p65基因在炎症细胞因子如TNF-α诱导的肺泡上皮细胞凋亡中起了重要作用。调控NF-κB活性,减少肺泡上皮细胞过度凋亡,可能成为治疗炎症失衡所致急性肺损伤的新靶点。