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目的:本研究旨在观察囊型包虫病患者(CE)外周血中单个核细胞(PBMC)表面TLRs及与血清细胞因子之间的相互关系,明确哪种模式识别受体(PRRs)参与了CE的慢性感染过程中IL-10的产生,讨论包虫病病人免疫耐受可能的原因;并进一步分析在包虫病患者PBMC衍生的树突状细胞(MoDC)形态、表型特点及成熟状态等,观察天然免疫细胞在包虫病病人中对免疫耐受的影响,从临床角度验证并分析包虫致宿主免疫耐受方面的机制。进而再通过体外实验应用包虫主要抗原刺激DCs后检测吲哚胺2, 3-双加氧酶(IDO)的表达,研究作为免疫耐受相关分子的IDO是否参与到了CE慢性感染中,并促进了宿主的免疫耐受,进一步确定TLRs、DCs与IDO之间有何联系,并且评价抗原B(AgB)潜在的免疫调节作用。方法:课题第一部分:采用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)法检测34例囊型包虫病患者(cystic echinococcosis,CE组)与22例健康对照者(healthy control,HC组)外周血单核细胞(PBMC)中TLR2、4mRNA的表达,GAPDH作为内参基因;应用ELISA方法检测两组血清中IFN-γ、IL-12p70、IL-10、IL-4、IL-17A的浓度,并且对TLR2、4的表达水平间及它们与血清细胞因子水平间的关系进行相关分析。课题第二部分:先分别采用磁珠分选法、贴壁法对正常人PBMC进行培养,应用重组人集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素-4(rhIL-4)诱导获得MoDCs。倒置显微镜、流式细胞术与混合淋巴细胞反应(MLR)评定获得的MoDCs质量;再根据所建立的人MoDCs的体外培养方法将CE患者、健康志愿者的PBMC诱导成为MoDCs后采用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞形态,流式细胞术检测MoDC表面标志物如CD1a、CD80、CD86、HLA-DR的阳性表达情况,并结合MLR检测两组MoDCs刺激同种异体T淋巴细胞的增殖能力,说明DCs是否存在表型缺陷与成熟障碍。课题第三部分:在体外实验的条件下,获得C57BL/6小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDCs),并进行鉴定。用15μg/ml rAgB刺激BMDCs 24h,采用细胞免疫组织化学法初步检测有无IDO表达;其次再分别应用15μg/ml rAgB、5mg/ml小鼠囊型包虫囊液(MHF)、1,000U/ml IFN-γ(阳性对照)刺激C57BL/6小鼠BMDCs,在6h、18h、24h、48h、60h采用QRT-PCR动态监测IDO、IL-10、TLR2、TLR4的mRNA相对表达情况;并在不同时间点收集各组DCs后应用Western blotting方法检测IDO的蛋白表达情况。利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)动态检测细胞上清中色氨酸的浓度以反映IDO的活性。结果:课题第一部分:慢性CE组的TLR2、TLR4的mRNA相对表达量均比HC组的表达增高(P<0.05);血清中细胞因子IL-10、IL-4、IL-12p70的浓度在CE组中均比在HC组中的浓度高,两组比较差异均具有统计学意义(P<0.05),但IFN-γ、IL-17A的浓度在两组中的差异则无统计学意义(P>0.05)。在CE组中,TLR2、TLR4分别与血清IL-10有正相关;TLR2与血清IL-12p70有相关性,但相关性弱。而TLR4则与血清IL-12p70无相关性。TLR与其它细胞因子无相关性,P值均>0.05。课题第二部分:经贴壁培养2 h后的人外周血PBMCs再行诱导可获得形态与功能较优的DCs,且此法稳定、简便、经济,是一种适于基础、临床研究的DCs体外培养方法。根据所建立的方法诱导出CE组、HC组的MODCs,并在倒置显微镜下观察到CE组MoDCs表面的树突状突起较少。与HC组比较,CE组的MoDCs细胞表面的CD1a、CD80、CD86、HLA-DR表达降低(P<0.05)。在MLR中,CE患者的MoDCs刺激T细胞增殖的能力低于HC组(P<0.05);课题第三部分:获得了纯度高且形态典型的DCs。经流式细胞仪的检测、MLR结果表明诱导形成的DCs表达相关表面标志物,且具有刺激T淋巴细胞增殖能力。QRT-PCR的结果显示,在rAgB-DCs组中,IDO在24h时明显上调,而IL-10、TLR2、TLR4均在48h时显著上调。在MHF-DCs组中,干预24h时IDO、IL-10、TLR2、TLR4均可被上调,并达到最高值。蛋白检测中发现,在rAgB组中,IDO在24h时出现明显条带,而从24h到60h,IDO的表达逐渐减弱。在MHF处理组中,DCs表达的IDO在48h时具有明显的条带。RP-HPLC结果显示,在各干预组处理DCs24h时,以rAgB组中Try的浓度为最低,IFN-γ为其次,MHF组中的Try浓度比rAgB、IFN-γ两组的都高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)TLR2、TLR4参与了囊型包虫病的慢性发生发展过程,TLR2、TLR4可作为囊性包虫抗原的受体,与不同抗原成分相互作用,调节宿主的免疫应答。TLR的表达参与了细胞因子的调节,使包虫逃避了宿主的免疫监视。在CE的慢性感染中,血清IL-10水平的分泌增高,可能在保护寄生虫的生长、在宿主体内存活以逃避宿主的免疫杀伤方面发挥作用,促使机体向Th2型免疫应答方向发展,形成了囊型包虫的慢性感染。(2)通过成功诱导人MoDCs,建立了研究DCs与包虫之间相互关系的平台;CE组所诱导的MoDCs形态不典型,表面标志物的表达降低,说明CE的MoDCs存在受损,成熟发生障碍及对T细胞的刺激能力减弱可能是包虫致免疫耐受的发病机制之一。(3)利用体外实验发现rAgB、包虫囊液都可以上调DCs表面IDO的表达。在一定时间内rAgB上调IDO表达的能力强于MHF上调IDO表达的能力;IDO与IL-10的mRNA水平分别在不同的时间点可被上调,并且IL-10mRNA的上调延迟于IDOmRNA的上调,说明IDO可通过TLR2、TLR4的上调并在细胞因子IL-10的作用下被激活。在CE的慢性感染过程中,IDO作为调节宿主反应的分子开关可能在Th2型反应中发挥着主导作用,形成了“IDO-依赖的免疫逃避”假说,显示了IDO可能抑制炎症反应,在棘球蚴致机体免疫耐受中起到了一定的作用,为进一步阐明囊性包虫病的天然免疫发病机制及探索新的免疫治疗靶点奠定基础。