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研究背景:环境内分泌干扰物（Environmental Endocrine Disruptors,EEDs）是一类常见的环境有害物质,其干扰内源性激素的合成、分泌、释放、运输、结合、效应及清除等各个环节,具有模拟或拮抗内源性激素的作用,从而导致生殖功能下降、结构畸形和肿瘤等的发生。其中邻苯二甲酸酯（Phthalates,PAEs）作为常用增塑剂,已成为全球最普遍的环境污染物之一,人群不可避免地处于低剂量邻苯二甲酸酯混合物（Phthalates Mixtures,MIXPs）的长期暴露中。因此,及早发现PAEs致生殖毒性的潜在风险,寻找保护因子并动态监测其对生殖系统的干预效果,具有重要的公共卫生意义。本课题组前期研究根据我国人群PAEs的实际暴露水平,经人-大鼠之间的种属系数换算后设定为暴露剂量,发现MIXPs长期低剂量暴露能够导致雄性大鼠生殖毒性,主要体现在性激素水平变化、睾丸组织病理改变、睾酮合成蛋白的表达水平改变等。并采用非靶标代谢组学技术,在大鼠尿液中筛选出了17种MIXPs的暴露标志物,其中有5种暴露标志物（雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、二氢睾酮、雌酮）与雄激素代谢途径相关,与雄性生殖毒效应密切相关。那么这5种暴露标志物是否亦有可能作为间接的毒效应指标,从而更为灵敏地表征PAEs暴露致大鼠雄性大鼠生殖毒性的早期效应?另一方面,我们发现强化锌干预能够抑制PAEs暴露导致的SD大鼠雄性大鼠生殖毒性,主要体现在锌干预回调了大鼠体重、雄性生殖器官的绝对质量和相对质量以及血清睾酮、黄体生成素（Luteinizing Hormone,LH）、卵泡刺激素（Follicle-stimulating Hormone,FSH）水平,改善睾丸组织病理学结构、睾酮合成关键蛋白的表达水平回调等。那么,5种暴露标志物若可作为间接毒效应指标,是否亦可评价保护因子（如锌）对雄性生殖系统毒性干预效果?在此基础上,本文研究如下:目的:本文基于靶标分析技术对非靶标代谢组学筛选出的与雄性生殖系统功能紧密相关的5种暴露标志物（雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、二氢睾酮和雌酮）进行定量分析,研究尿液中该5种暴露标志物同时是否可作为间接毒效应指标以判断雄性大鼠生殖毒性,另一方面,通过锌对PAEs致雄性大鼠生殖毒性干预实验,研究5种暴露标志物的变化是否可作为评价PAEs致雄性大鼠生殖毒性干预效果的指标。方法:（1）动物实验方法:实验选择清洁级6周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠50只,体重180-220 g。50只雄性SD大鼠随机分成5组（n=10）,即A:正常对照组（NC）;B:锌缺乏对照组（ZD）;C:MIXPs暴露组（MIXPs）;D:MIXPs暴露-锌缺乏组（MIXPs-ZD）;E:MIXPs暴露-锌强化干预组（MIXPs-ZE）。其中,A组大鼠常规饲料饲养,每天5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液等剂量灌胃;B组大鼠锌缺乏饲料饲养;C组大鼠常规饲料饲养,同时经口灌胃160 mg/kg/d MIXPs;D组大鼠锌缺乏饲料饲养,同时经口灌胃160 mg/kg/d MIXPs;E组大鼠常规饲料饲养,同时经口灌胃160 mg/kg/d MIXPs和13 mg/kg/d ZnSO4（补充5.25 mg/kg/d的锌元素）。所有大鼠均连续灌胃90天,在染毒第0天及第30、60、90天分别收集大鼠24小时尿样。（2）靶标化合物分析方法的建立与评价:LC-MS/MS方法用于尿液中雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮和二氢睾酮的检测。色谱柱为ACQUITY UPLC?BEH C18（100mm×2.1mm×1.7μm）,柱温30°C;流动相A为水（0.1%甲酸）,B为乙腈,采用非线性梯度洗脱,流速为0.4 mL/min,进样量为5μL。在电喷雾离子化（ESI）正离子扫描模式下首先确认目标物的母离子,后进行子离子扫描确认定性离子对和碰撞能量。HPLC-DAD方法用于尿液中雌酮的检测。色谱柱为Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm×5μm）,柱温30°C;流动相A为水（0.1%甲酸）,B为乙腈,采用等梯度洗脱,程序为:A为30%,B为70%,流速为1.0 mL/min。进样量为20μL,检测波长为230 nm。结果:（1）5种靶标化合物的检出限分别为雄烯二酮（0.02 ng/mL）、睾酮（0.01 ng/mL）、脱氢表雄酮（0.15 ng/mL）、二氢睾酮（0.12 ng/mL）和雌酮（1 ng/mL）。线性范围分别为雄烯二酮（0.06100 ng/mL）、睾酮（0.03100 ng/mL）、脱氢表雄酮（0.5100 ng/mL）、二氢睾酮（0.4100 ng/mL）和雌酮（3100 ng/mL）。大鼠尿液进行加标回收率实验结果表明5种靶标化合物的回收率为88.2%110.0%,相对标准偏差（RSD）小于15.8%（n=6）,具有良好的方法准确度和精密度。与文献方法相比,雄烯二酮、睾酮和二氢睾酮检测灵敏度更高。大鼠尿液中雌酮的检测是基于本课题组自主研发的PA6纳米纤维膜的固相萃取前处理方法,萃取介质和有机溶剂消耗少,方法简便;方法回收率达到88.2%110.0%,满足实际样品检测要求。（2）尿液实际样品检测:大鼠尿样中靶标化合物的水平为经尿肌酐含量校正的检测浓度。MIXPs暴露大鼠90天导致大鼠尿液中雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮和二氢睾酮浓度水平较对照组增高,且在第60天时,这4种暴露标志物浓度与对照组相比均显著升高（P<0.05）。然而,尿液中雌酮响应值的变化与这4种暴露标志物的变化趋势相反,呈下降趋势,从第30天开始,大鼠尿液中雌酮水平与对照组相比均出现显著下降（P<0.05）。锌缺乏饲料喂养大鼠90天导致大鼠尿液中5种暴露标志物水平较对照组相比显著降低（P<0.05）。MIXPs-锌缺乏暴露组大鼠尿液中5种暴露标志物水平变化和时效变化趋势同MIXPs暴露组。MIXPs-锌强化暴露大鼠90天导致大鼠尿液中5种暴露标志物水平较MIXPs暴露组均出现明显回调（P<0.05）,趋于对照组水平。MIXPs-锌强化暴露大鼠90天导致大鼠尿液中5种暴露标志物水平较MIXPs-锌缺乏暴露组也出现了明显回调（P<0.05）,趋于对照组的水平。结论:（1）基于C18固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法和PA6纳米纤维固相萃取-高效液相色谱法建立了灵敏、准确的大鼠尿液中5种暴露标志物（雄烯二酮、睾酮、脱氢表雄酮、二氢睾酮和雌酮）的分析测定方法。（2）尿液中5种暴露标志物可以作为判断PAEs致雄性大鼠生殖毒性间接毒效应指标以及锌干预PAEs致雄性大鼠生殖毒性早期治疗判断的指标,可望为PAEs暴露毒效应发生风险的预测预警,实现早发现、早干预,对干预措施及其干预效果的评价等提供客观依据。尿样取样方便,有利于实现无创、动态地监测PAEs暴露导致的雄性大鼠生殖毒性,同时检测5种靶标化合物也有助于提高毒效应监测的可靠性。