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茉莉C病毒(Jasmine vius C,JaVC)是香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)的一个新成员,通常与茉莉T病毒(Jasmine virus T,JaVT)和茉莉H病毒(Jasmine virus H,JaVH)复合侵染茉莉。该病毒首次在台湾报道,研究发现JaVC的存在可能与茉莉叶片出现的黄化嵌纹病征相关。2017年本实验室发现福建地区的茉莉叶片也呈现黄化嵌纹病征,经鉴定带有JaVC病毒;本研究获得了 JaVC福建分离物全长序列,并构建了 JaVC-FJ全长侵染性cDNA克隆。其次,为了明确我国其他茉莉产区JaVC病毒的携带以及变异情况,克隆了四川、云南、广西、湖南、广东、福建、江苏、山东和吉林九个省茉莉JaVC分离物的3’末端包含病毒外壳蛋白(Coat protein,CP)全长的片段,通过比对分析了 CP的核苷酸和氨基酸序列,研究了不同地域下同种病毒的分子变异情况,为JaVC病毒的检测和基因功能的研究提供了依据。另外,JaVC的传播、核酸的包被以及研究该属病毒遗传多样性都与其编码的CP蛋白密切相关,因此本研究克隆了 JaVC的CP基因,进行了原核表达,制备了多克隆抗体。主要研究结果如下:1.JaVC侵染性cDNA克隆的构建本研究根据GenBank登录号为NC030926的序列分段设计引物,采用分段RT-PCR的方法(分为3个片段),扩增了 JaVC福建分离物的三个DNA片段,利用无缝克隆技术,构建了 JaVC的全长cDNA克隆,命名为pXT-JaVC。采用两种方法检测该病毒的侵染性,其一直接利用农杆菌注射接种的方法侵染本生烟,在接种5天后,提取本生烟侵染叶和系统叶的总RNA,RT-PCR检测JaVC基因的特异性片段;其二构建了 CP融合红色荧光蛋白mCherry的pXT-JaVC质粒载体,利用农杆菌注射接种的方法侵染本生烟,在激光共聚焦扫描显微镜观察到本生烟细胞内有红色荧光的特异性聚集,进一步证实了JaVC具有侵染性。2.JaVC九个省茉莉分离物CP基因的克隆和序列分析采用RT-PCR的方法,扩增了四川、云南、广西、湖南、广东、福建、江苏、山东和吉林九个省茉莉中JaVC的CP基因,构建重组质粒pTOPO-CPX(X代表不同省份),并与JaVC台湾分离物的CP基因序列进行对比,这10个CP基因的核苷酸序列的相似性为82.27%～91.36%,氨基酸序列的相似性为92.23%～96.82%。其中JaVC台湾分离物CP基因核苷酸序列与广东相似性最高,并且进化树分析显示,台湾、广东、四川、福建、吉林、云南分为一组,山东、广西、湖南、江苏为另一组,其中并未找到分组规律,因此寄主的地域性差异是否影响JaVC的分类这一问题,还有待下一步实验的研究。3.CP基因的表达和多克隆抗体的制备利用PCR技术扩增得到JaVC CP基因,插入原核表达载体pET-28a(+)获得重组质粒pET-28a-CP。转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导和Ni-NTA Agarose亲和层析柱纯化,获得分子质量约为33 kDa的重组蛋白,免疫新西兰大白兔制备了抗体。