免疫调节药物及Cereblon对下游蛋白泛素化降解调控的机制研究

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研究背景及目的:智力发育缺陷在我国的发病率达到0.6%,由多种因素导致这类疾病,但大部分是遗传基因突变引起的。研究报道,cereblon(CRBN)的两个突变体R419X和C391R会导致智力发育缺陷。CRBN主要通过与DNA损伤结合蛋白1(DDB1)、cullin 4A、Cullins调控蛋白1(ROC1)形成CRL4 E3泛素连接酶复合体发挥作用,介导目标蛋白质的泛素化和蛋白酶体途径降解。前期实验发现沙利度胺及其结构衍生物来那度胺和泊马度胺等免疫调节药物(IMiDs)均能与CRBN结合,并调控CRL4CRBN E3泛素连接酶活性。在有无IMiDs时,CRBN可以调控多个蛋白,如Nogo A、氯离子通道CLC-1、转录因子IKZF1、原癌基因蛋白c-Jun。但CRBN及其突变体对下游蛋白是如何调控的,这些调控如何受IMiDs的影响,这些调控是否与它们和CRBN结合的区域相关等问题还不清楚。本论文将试图回答这些问题。研究方法:在HEK293T细胞中过表达CRBN及其突变体和CRBN相互作用蛋白,利用免疫印迹检测CRBN突变对其相互作用蛋白水平的调控。用放线菌酮(cycloheximide)处理HEK293T细胞,利用免疫印迹检测CRBN及其突变体的降解速率,及CRBN对其底物蛋白Nogo A稳定性的影响。用蛋白酶体抑制剂(MG132)处理HEK293T细胞,利用免疫印迹检测CRBN及其突变体的稳定性,以及MG132对IMiDs对CRBN相互作用蛋白的调控。用免疫共沉淀和免疫印迹法检测CRBN与其作用蛋白的结合区域,探究IMiDs对CRBN与其底物相互作用强弱的影响,以及IMiDs对CRBN结合蛋白泛素化的影响。在果蝇中过表达或敲低CRBN,并在不同神经元表达绿色荧光蛋白(GFP),用共聚焦显微镜观察果蝇大脑神经元的形态变化,探究CRBN对神经元的影响。研究结果:放线菌酮处理HEK293T细胞后,CRBN C391R突变体比野生型(WT)和R419X突变体降解显著变慢,半衰期延长。用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞,与WT和R419X相比,锌指结构区域的四个半胱氨酸突变体蛋白(C323R、C326R、C391R、C394R)水平回升较小,说明它们都比较稳定,其中C391R最为稳定。WT和R419X均能显著降低Nogo A蛋白水平,而C391R这一突变体对NogoA影响并不大。当共转CRBNWT或R419X时,Nogo A蛋白降解较快,而共转C391R时Nogo A蛋白降解较慢。C391位的其它突变体对Nogo A的影响均比WT小,且锌指结构区域的半胱氨酸-精氨酸突变体对NogoA的影响也较小。果蝇脑解剖实验由于没有合理地控制实验条件,我们的初步结果无法获得可靠的结论,需要后续实验进一步研究。免疫沉淀和免疫印迹实验发现CRBN蛋白的82-186氨基酸区域是CLC-1、IKZF1的结合位点。IMiDs可以明显降低IKZF1的蛋白水平,但可以升高MEIS2的蛋白水平,并且共转CRBN时IKZF1和MEIS2的蛋白水平均有一定程度的下降。IMiDs可以降低CLC-1蛋白水平,但对c-Jun蛋白水平没有太大影响,并且当共转CRBN时,CLC-1和c-Jun的蛋白水平均下降。IMiDs不改变c-Jun的泛素化,但能降低MEIS2的泛素化并促进CLC-1的泛素化。IMiDs不改变c-Jun与CRBN的相互作用,但能降低MEIS2与CRBN的相互作用并增强CLC-1与CRBN的相互作用。蛋白酶体抑制剂MG132均可以升高CRBN底物的蛋白水平。研究结论:CRBN WT的锌指结构可以促进Nogo A的泛素化和蛋白酶体降解,而C391R突变体没有正常的锌指结构,减弱Nogo A的泛素化并导致Nogo A蛋白的积聚。没有免疫调节药物沙利度胺及其结构衍生物时,CRBN可以与c-Jun、CLC-1、MEIS2结合,促进它们的泛素化和蛋白酶体降解,从而降低它们的蛋白水平。免疫调节药物增强了 CRBN与CLC-1/IKZF1的结合,减弱了 CRBN和MEIS2的结合,从而影响它们的泛素化和蛋白水平。但免疫调节药物不影响CRBN与c-Jun的结合。本文证实了锌指结构对CRBN稳定性及功能均有重要影响,在CRBN上的结合区域是影响IMiDs对CRBN相互作用蛋白泛素化和稳定性调控的关键因素。
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