研究背景：胃癌(gastric cancer, GC)是目前世界上发病率第四位的恶性肿瘤,其相关死亡率居所有恶性肿瘤的第二位,消化道恶性肿瘤的首位。由于其发病隐匿,临床症状在早期不明显,多数病人—经发现已处于临床晚期,总体5年生存率仅30%左右,严重威胁着人民的生命和健康。而迄今为止,胃癌的发病机制尚未完全明确,不能满足临床对胃癌进行有效预防及治疗的需要。因此,探索胃癌发病机制、寻找胃癌新的肿瘤标志物及基因治疗靶点用于胃癌的早期诊断、复发转移预测和预后评估对于胃癌防治具有重要作用。近年来,随着胃癌分子生物学研究的不断深入,针对肿瘤细胞生长、凋亡、细胞周期、侵袭浸润等分子生物靶点的寻找成为胃癌基础研究的重点和热点。Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein,RKIP)属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein, PEBP)家族,是一种高度保守、广泛表达、具有多种生理与病理功能的小分子胞浆蛋白。参与多条信号转导通路的调控,如Raf-1-MAPK、NF-κB和G蛋白信号通路等,在细胞生长、增殖、分化、凋亡等生理过程中发挥重要作用。此外,近年来的研究表明RKIP是一个新的转移抑制基因,可以抑制前列腺癌、人乳腺癌和黑色素瘤等肿瘤细胞的转移,体外干预实验证实RKIP表达减少可以影响肿瘤转移、血管生成,抵抗凋亡,破坏染色体的完整性,在肿瘤的浸润与转移中起到重要的作用,可以作为判断某些肿瘤预后的分子标志物和肿瘤治疗的新靶标。本实验组张志强等的研究也显示RKIP在胃癌组织中表达下调或缺失,其表达改变可能与胃癌的发生、分化、浸润及转移有关[7]。但RKIP在胃癌发生、发展、浸润、转移中的具体作用及其机制如何,目前国内外研究报道较少。本研究是在前期研究的基础上,分析RKIP从癌前状态到最终癌变、转移这一系列胃粘膜癌变动态演变过程中的表达改变,寻找RKIP蛋白表达异常与胃粘膜癌变之间的关系。为明确RKIP基因在胃癌中的作用并考察其表达上调对胃癌恶性表型的影响,我们借助基因转染技术,构建RKIP(?)急定表达的胃癌细胞株SGC7901,研究RKIP基因在胃癌细胞增殖、生长、迁移、侵袭及凋亡中的作用,阐明RKIP在胃癌发生、分化及转移中扮演的角色。为进一步研究RKIP抑制胃癌的作用机制,我们分析了Cyclin D1、STAT3、ADAM-12这些与细胞增殖、凋亡、信号转导关系密切的基因及蛋白的表达与RKIP表达在胃粘膜癌变动态过程中的相互关系,探寻RKIP蛋白抑制胃癌发展、转移及肿瘤分化可能的作用机制,为胃癌的诊断、预后监测以及基因治疗提供依据和新的线索。第一章胃粘膜癌变不同阶段组织中Raf激酶抑制蛋白的表达及其临床意义目的：检测癌前状态、早期胃癌组织、进展期胃癌组织及转移淋巴结组织中RKIP蛋白的表达,并结合患者的临床病理资料进行统计学分析,探讨RKIP蛋白在癌前疾病、癌前病变到胃粘膜癌变不同阶段的表达变化,明确RKIP蛋白表达异常与胃粘膜癌变之间的关系,探讨RKIP在胃粘膜癌变中的可能作用。方法：免疫组化检测癌前状态组织88例(包括胃腺瘤性息肉7例、胃溃疡27例、异型增生组织及肠化组织54例,其中轻中度异型增生17例,重度异型增生23例,伴肠化生26例)、早期胃癌组织48例、进展期胃癌组织121例及36例胃癌转移的淋巴组织中RKIP蛋白的表达,分析RKIP在胃粘膜癌变不同分化阶段的表达与临床病理学特征的关系。结果：RKIP蛋白主要在胞浆表达,呈黄色到棕褐色颗粒,RKIP阳性表达如下：胃癌前状态88例,阳性表达62例(70.5%)；早期胃癌组织48例,阳性表达32例(66.7%)；进展期胃癌组织121例,阳性表达36例(29.8%)；36例胃癌转移的淋巴组织,阳性表达1例(2.8%)。RKIP阳性表达率在癌前状态组及早期胃癌组高表达,但两组比较无显著统计学差异(P>0.05),RKIP在不同程度的癌前病变(肠化及异型增生)中的阳性表达也无显著差异(P>0.05)。而在进展期胃癌组织中其表达水平较非癌良性癌前状态及早期胃癌组显著降低(P<0.05),在转移的淋巴结组织中其表达水平进一步降低,与癌前状态及早期、进展期胃癌组比较,均具有显著统计学差异(P<0.05)。免疫组化图片使用图像分析软件Image-Pro Plus6.0扫描,结果取累积光密度值(IOD)做统计分析,采用非参数秩和检验,统计分析显示RKIP表达水平在癌前状态组与早癌组织中没有显著差异,P=0.151；而在进展期胃癌及转移淋巴结组织中表达水平较癌前状态组显著下降,P<0.001；其在转移淋巴结组织阳性表达与进展期胃癌比较亦有显著下降,P<0.001。与免疫组化结果一致。RKIP在不同类型的胃癌组织中的表达如下：RKIP蛋白在浸润至粘膜及粘膜下层、肌层、全层的胃癌组织中的表达率分别为68.8%、35.3%、20.8%；在高、中、低分化腺癌中表达率分别为：42.9%、41.9%、39.5%；在肠型和弥漫型胃癌中的表达率分别为：41.6%、38.2%；在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ/Ⅳ期胃癌中的表达率分别为：68.3%、47.8%、24.5%；在有淋巴结转移和无转移的胃癌组织中的表达分别为：22.7%、70.8%。RKIP蛋白表达与胃癌的浸润深度、TNM分期及淋巴结转移呈负相关(P<0.001),但RKIP蛋白表达与患者年龄、性别无关,RKIP在高、中、低分化腺癌中的表达以及在肠型及弥漫型胃癌中的表达水平无显著差异(P>0.05)。此外169例胃癌病理报告中,其中52例有Hp检测报告,32例Hp阳性,20例Hp阴性,合并Hp感染的胃癌中RKIP阳性表达率为43.8%,Hp阴性胃癌的RKIP阳性表达率为40.0%,统计分析显示RKIP在胃癌中的表达与Hp感染无明显相关(P>0.05)。结论：1.RKIP在癌前状态与早期胃癌组织高表达,在进展期胃癌及转移淋巴组织中低表达。2.RKIP在肠型胃癌和弥漫型胃癌中表达无显著差异,与胃癌分化程度及幽门螺杆菌感染亦无明显相关。3.RKIP表达水平与胃癌的浸润深度、TNM分期及淋巴结转移呈负相关。可作为判断胃癌预后的重要指标。第二章上调RKIP基因表达对胃癌细胞生物学行为的影响目的：RKIP表达质粒稳定转染RKIP低表达胃癌细胞株SGC7901,体内外实验明确RKIP对胃癌细胞增殖、侵袭、凋亡、细胞周期及裸鼠成瘤的影响。方法：采用脂质体介导转染技术,将RKIP真核表达重组质粒pcDNA3.1(+)/RKIP和空载体质粒分别导入RKIP低表达的胃癌细胞系SGC7901。q-RT-PCR和Western blot分别检测RKIP mRNA及蛋白质表达,并借助细胞生长曲线、软琼脂集落形成实验观察RKIP基因对胃癌细胞增殖的作用；划痕试验及Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力和侵袭力的变化；流式细胞计数观察RKIP表达对胃癌细胞的细胞周期和凋亡率的影响；并建立人胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,观察RKIP对胃癌细胞增殖和转移能力的影响。结果：转染RKIP基因的SGC7901细胞RKIP mRNA表达较未转染组增加4.41±0.56倍,Western blot分析显示RKIP蛋白质表达量显著增加,表明RKIP基因稳定表达的胃癌细胞系SGC7901构建成功。RKIP基因转染的SGC7901细胞生长速度明显减慢,从第4天起与空载体转染组及未转染组SGC7901细胞相比存在明显差异(P<0.001)。在软琼脂中集落形成RKIP基因转染组、空载体组和未经转染组集落形成数(×102)分别20±4,57±7和59±9,转染RKIP基因组克隆形成能力明显下降(P<0.05)。细胞划痕后18h.RKIP基因转染组细胞划痕宽度2.91±0.21mm,而空白及空载体对照组分别为1.26±0.41mm,1.31±0.34mm,RKIP基因转染组划痕恢复慢,与其他两组对比均有显著差异(P<0.05),转染RKIP基因使肿瘤细胞迁移能力下降。Transwell实验显示空白对照组及空载体组穿过基质膜细胞数分别为(256.5±37)个和(276.5±40)个,转染RKIP基因组则为(107.0±20)个,转染组穿过基质膜细胞数与其他两组对比显著减少(P<0.05),转染组侵袭能力明显受抑制。流式细胞计数发现,RKIP转染组G0-G1的细胞百分比(69.34±1.37%)较空载体转染组(63.42±0.49%)和未转染组(62.45±0.91%)明显增多,而RKIP转染组G2-M,S的细胞百分比(G2-M：8.21±1.64%,S：19.78±1.14%)较空载体转染组(G2-M：11.91±0.23%,S：24.67±0.27%)和未转染组(G2-M：13.71±2.36%,S：23.85±2.41%)明显减少(P<0.05),转染RKIP组细胞凋亡率较未转染对照组及转染空载体组明显增加(3.59±0.51%vs1.07±0.29%,2.10±0.87%),差异有统计学意义(P=0.006)。裸鼠接种实验显示,空载体转染组和未经转染的SGC7901裸鼠组在接种后平均7天就可以长出明显的包块,而RKIP基因转染组长出肿瘤的时间显著延长,平均为21天,同时肿瘤瘤体生长缓慢。将瘤体积变化对时间绘制瘤体生长曲线,pcDNA3.1(+)-RKIP/SGC7901接种的移植瘤体积较空白组及空载体组明显减小,在第7,14,21,28,35,42天对三组移植瘤体积的均数进行统计学分析,结果表明具有显著性差异(P<0.05)。6周后处死裸鼠,取出瘤块,称取瘤质量。pcDNA3.1(+)-RKIP转染组肿瘤体积明显小于空载体转染组和未经转染组,差异有统计意义(7.36±2.10g vs13.63v1.61g,14.03±3.51g,F=6.503,P=0.03),说明RKIP重表达可以明显抑制SGC7901细胞在裸鼠中的移植瘤生长能力。结论：1)SGC7901胃癌细胞系RKIP mRNA和蛋白低表达,提示RKIP的低表达可能与胃癌有关。2)RKIP能抑制SGC7901胃癌细胞的体外增殖能力和侵袭力。3)成功建立转染组和对照组SGC7901胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,RKIP基因转染可以抑制裸鼠移植瘤的生长,降低SGC7901胃癌细胞的致瘤性。4)RKIP对SGC7901胃癌细胞生长的抑制作用与其干预胃癌细胞周期、促进细胞凋亡有关。5)RKIP基因重表达有助于SGC7901的恶性表型逆转,有望成为肿瘤治疗的有效靶点。第三章Raf激酶抑制蛋白抑制胃癌侵袭转移的作用机制的初步研究目的：探讨胃癌细胞及良性癌前状态、胃癌、转移淋巴结组织中的RKIP表达与Cyclin D1、STAT3、ADAM-12表达的关系,并探讨它们表达与胃癌临床病理的关系,为探索RKIP抑制胃癌侵袭转移的作用机制提供新的实验依据。方法：q-RT-PCR检测稳定转染RKIP基因的胃癌细胞SGC7901中的Cyclin D1、STAT3、ADAM-12mRNA表达变化,在体外从细胞水平探讨RKIP基因抑制胃癌的作用机制是否与调控Cyclin D1、 STAT3及ADAM-12的表达有关。再采用免疫组化检测癌前状态组织88例；早期胃癌组织30例、进展期胃癌组织60例及25例胃癌转移的淋巴组织中Cyclin D1、STAT3、ADAM-12蛋白表达及其与胃癌的临床病理特征的关系,分析RKIP表达与Cyclin D1、STAT3、 ADAM-12表达在胃粘膜癌变过程中的相互关系。结果：(1)RKIP基因转染组的CyclinD1、STAT3、ADAM12mRNA表达量分别为未转染组的0.405±0.073倍、0.578±0.274倍、0.673±0.447,转染载体组中三个基因mRNA表达量分别为未转染组的1.038±0.543倍、1.772±1.078倍、1.003±0.434倍。RKIP基因转染组胃癌细胞中的cyclinD1、STAT3基因表达显著下调(P<0.05),而RKIP基因转染后ADAM12基因表达与其他两组比较无明显差异(P>0.05)。(2)STAT3蛋白在胃癌前状态组、早期胃癌、进展期胃癌组织、转移淋巴组织的阳性表达率分别为例26.1%(23/88)、66.7%(20/30)、71.6%(43/60)、64.0%(16/25)。与胃癌前状态组比较,STAT3蛋白在早期胃癌、进展期胃癌及转移淋巴结组织其表达阳性率均显著升高,差异具有统计意义(P<0.001)。STAT3蛋白表达与胃癌的浸润深度、TNM分期、淋巴结转移及肿瘤分化程度呈正相关(P<0.05),但在肠型胃癌和弥漫型胃癌中表达无显著差异(P>0.05)。(3)CyclinDl蛋白在胃癌前状态组、早期胃癌、进展期胃癌组织、转移淋巴组织的阳性表达率分别为23.9%(21/88)、63.3%(19/30)、73.3%(44/60)、52.0%(13/25)。与胃癌前状态疾病比较,早期胃癌、进展期胃癌以及转移淋巴结组织中Cyclin D1蛋白阳性表达率均显著升高,差异具有统计意义(P<0.05)。CyclinD1蛋白表达与胃癌的分化程度及淋巴结转移呈正相关(P<0.05),并与胃癌分型有关,CyclinD1在弥漫型胃癌中阳性表达率较肠型胃癌高(P=0.001),与胃癌的浸润深度、TNM分期无明显相关(P>0.05)。(4)ADAM-12蛋白在癌前状态、早期胃癌、进展期胃癌、转移淋巴组织的阳性表达率分别为44.3%(39/88)、53.3%(16/30)、55.0%(33/60)、36%(9/25)。ADAM-12蛋白在癌前状态、早期、进展期胃癌以及转移淋巴结组织中的表达各组间均无显著差异(P>0.05)。(5)Cyclin D1、STAT3、ADAM-12累积光密度值(IOD)定量分析结果与免疫组化结果一致。(6)相关性分析表明RKIP蛋白与CyclinD1蛋白表达两者呈负相关(r=-0.411,P<0.001)；RKIP和STAT3两者表达呈负相关(r==-0.640,P<0.001)；CyclinD1、STAT3两者表达呈正相关(r=0.305P=0.004)。结论：1)RKIP基因转染可以抑制胃癌细胞株SGC7901中STAT3及cyclin D1、表达。2)STAT3、CyclinD1蛋白在早期胃癌、进展期胃癌及转移淋巴结组织中高表达,与胃癌的分化程度及淋巴结转移呈正相关。3)RKIP在胃癌组织中的表达与STAT3、CyclinD1蛋白的表达呈负相关,胃癌组织中STAT3、CyclinD1蛋白的表达正相关。4)ADAM12在胃癌前状态、胃癌以及转移淋巴结组织各组间表达均无显著差异。图52幅,表22个,参考文献148篇。