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随着养殖业的快速发展,抗生素已被广泛用于治疗疾病或促进动物生长。但是,严重的抗生素滥用现象已经引起了人们的关注。抗生素的滥用不仅导致了超级细菌的出现,还会污染环境影响着人类的健康。多西环素(Doxycycline,DOX)作为四环素的一种,可以作用于线粒体核糖体小亚基,阻断氨酰tRNA进入核糖体A位,抑制蛋白质合成。在养猪业,多西环素主要通过添加到饲料和饮水中使用,直接作用于肠道上皮细胞。小肠上皮作为营养吸收的主要部位,需要消耗大量的能量,细胞内含有丰富的线粒体。多种病原体或化学物质会影响肠上皮线粒体动态平衡,破坏细胞稳态。目前为止,多西环素对肠上皮细胞线粒体的影响还未见报道。因此,为了探究多西环素在养猪业使用中是否会影响肠上皮的正常功能,我们应用猪空肠上皮细胞IPEC-J2作为体外肠道上皮模型,首先研究了多西环素是否会抑制IPEC-J2细胞活力,以及对细胞线粒体状态的影响;其次研究多西环素诱导细胞自噬以及完整的线粒体自噬;再次研究了多西环素诱导的线粒体自噬对IFNβ产生的影响;最后研究了多西环素导致的肠上皮细胞先天性免疫抑制对猪传染性胃肠炎病毒TGEV复制的影响。具体内容如下:1.多西环素对IPEC-J2细胞活力以及线粒体状态的影响多西环素会抑制多种肿瘤细胞增殖,引起细胞凋亡。主要是因为多西环素靶向线粒体核糖体,抑制线粒体蛋白合成。为了研究多西环素是否会抑制IPEC-J2细胞增殖,我们通过CCK-8法检测了不同浓度的多西环素以及多西环素处理不同时间对IPEC-J2细胞活力的影响。结果表明,在养殖业使用的浓度范围内多西环素都不会抑制细胞增殖。为了研究多西环素对细胞凋亡的影响。我们用流式细胞术检测了1,50,100(μg/ml)多西环素处理24h,50 μg/ml多西环素处理24h,48h,72h细胞凋亡水平。结果表明,多西环素不会引起IPEC-J2细胞凋亡,反而会稍微抑制细胞的凋亡水平。为了研究多西环素是否影响线粒体状态,通过流式细胞仪检测多西环素处理后IPEC-J2细胞异常线粒体(MitoTracker Red)和总线粒体(MitoTracker Green)的变化,细胞中总的活性氧ROS(DCFH-DA)和线粒体ROS(MitoSox)的变化和线粒体膜电位(Rh123)的变化。结果表明,多西环素处理会显著增加线粒体受到损伤的细胞比例。多西环素50 μg/ml(P<0.01)和多西环素100 μg/ml(P<0.01)会显著增加ROS以及mitoROS的水平,并呈剂量依赖性。而且会显著促进氧化应激相关基因转录水平的表达,表明多西环素处理会导致细胞一定水平的氧化应激。但是,多西环素处理却不会影响线粒体膜电位。以上结果显示,多西环素虽然不会抑制IPEC-J2细胞增殖,但是会引起细胞内受到损伤的线粒体积累,诱导细胞氧化应激。2.多西环素诱导IPEC-J2细胞完整的细胞自噬以及线粒体自噬多西环素会引起细胞内损伤线粒体的积累,但并不会引起细胞凋亡。细胞自噬会清除细胞内损伤的线粒体,以维持细胞稳态。首先,为了研究多西环素是否诱导IPEC-J2细胞自噬。通过Western-blot检测了 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的变化,通过荧光显微镜观察GFP-LC3B的分布。结果表明,多西环素50 μg/ml(P<0.01)和100 μg/ml(P<0.001)会显著增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达。细胞中GFP-LC3B puncta数量也剂量依赖性增加。为了进一步验证多西环素是否诱导IPEC-J2细胞线粒体自噬以清除损伤线粒体。通过透射电镜观察了多西环素处理后细胞线粒体的结构变化,并通过激光聚焦显微镜观察IPEC-J2细胞内线粒体和自噬体共定位现象。结果表明多西环素处理24h后,线粒体形态出现明显肿胀变形,嵴消失,并观察到明显的双层膜包裹的线粒体。并可见明显的线粒体与自噬体的共定位,随着浓度的增加,共定位现象更加明显。为了研究多西环素诱导的线粒体自噬体是否与溶酶体结合,通过mRFP-GFP-Bcl-xL融合蛋白观察自噬体被酸化降解观察。结果表明,随着时间的增加,自噬体酸化程度不断增加。以上结果表明,多西环素可以引起完整的线粒体自噬,以清除损伤线粒体。3.多西环素对先天性免疫的影响线粒体是先天性免疫信号转导平台,线粒体自噬会抑制RLR信号的传导,抑制I型IFN的产生。为了研究多西环素处理对IFNβ的影响。通过RT-PCR检测了多西环素处理对转染poly(I:C)诱导的IFNβ,IFIT1,DDX58mRNA水平的变化。结果表明,多西环素 50 μg/ml(P<0.001)和 100 μg/ml(P<0.001)显著抑制转染 poly(I:C)引起的IFNβ,IFIT1,DDX58的转录,并呈剂量依赖性。同时我们通过双荧光素酶报告基因检测系统,检测了多西环素对细胞(干扰素刺激响应元件)ISRE活化的影响。结果表明,多西环素会显著抑制转染poly(I:C)诱导的ISRE的活化。为了进一步验证多西环素抑制IFN-I反应是否与线粒体自噬有关。我们在IPEC-J2细胞上干扰ATG5,结果表明,ATG5干扰会显著增加多西环素引起的线粒体损伤,消除了对IFNβ产生的抑制。以上结果表明,多西环素引起的线粒体自噬会显著抑制IPEC-J2细胞Ⅰ型干扰素反应。4.多西环素会促进TGEV在IPEC-J2细胞上的复制。先天性免疫反应是细胞抵抗病毒感染的第一道防线。为了研究多西环素抑制细胞IFN产生是否会影响病毒的复制。我们通过TCID50的测定和空斑实验检测了多西环素处理后TGEV感染IPEC-J2细胞24h的病毒滴度。结果表明多西环素会显著促进TGEV在肠上皮细胞的复制。同时在干扰ATG5的细胞上,多西环素不会促进TGEV的复制。以上结果表明,多西环素作用于IPEC-J2细胞会促进TGEV的复制。本论文以猪小肠上皮细胞为模式细胞,证明了多西环素会诱导细胞线粒体自噬,抑制细胞先天性免疫反应,促进TGEV的复制。为揭示抗生素滥用引起的副作用提供理论基础。提示我们合理使用抗生素的重要性。