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背景与目的随着酒精饮料消费的不断增加,酒后暴力事件逐渐增多,特别是酗酒后轻微外力所致的外伤性蛛网膜下腔出血(traumatic subarachnoid haemorrhage, TSAH)死亡案件常有发生,且已引起当前国内外法医工作者注意和重视。许多学者定义TSAH为较轻的钝性外力打击引起的致命性弥漫性蛛网膜下腔出血,其典型特征为发生于酗酒后。本课题组已建立稳定的大鼠灌酒后TSAH模型,结果为灌酒后大鼠TSAH出血率:慢性组82.4%、急性组28.6%;死亡率:慢性组58.8%、急性组0,表明慢性灌酒TSAH死亡率远大于急性灌酒组。但是慢性灌酒大鼠TSAH高死亡率机制尚不完全清楚。由于国内外未见相关的研究报道及系统研究,同时给法医学死因分析、司法审判量刑带来一定的困难。这正是关于TSAH案例法医学鉴定、死因分析,及其司法审判量刑中极其重要而迫切需要解决的问题之一。据此,进行课题立项,深入探讨灌酒大鼠TSAH的高死亡率机制。鉴于前期对死亡机制的研究工作主要从慢性灌酒后神经元量能代谢、凋亡、血管生物力学以及暗神经元方面展开,并取得了相应的成果。机体抗应激能力对于生物的生存具有重要意义。然而,从长期慢性灌酒后致机体应激变化方面探讨慢性灌酒高死亡率机制报道较少。本研究旨在前期所建立的大鼠灌酒后TSAH模型基础上,通过观察大鼠慢性灌酒后nNOS和HSP70的表达情况,从慢性灌酒后应激的改变、应激改变对机体的影响等方面进一步的探讨死亡机制,以期为此类案件的法医学鉴定和临床防治提供科学理论依据。材料与方法1实验动物及分组情况SPF雄性SD (Sprague-Dawley)大鼠61只,体重300±50g,分笼饲养,随机分为急性和慢性组。急性组再分为急性灌酒打击组、急性单纯灌酒组、急性灌水打击组、急性单纯灌水组4组,每组7只,共28只;按15ml/Kg一次性给予胃内灌注。慢性组分为慢性灌酒打击组、慢性灌酒停酒打击组、慢性单纯灌酒组,分别为19只、7只及7只计33只;其中慢性灌酒打击组和慢性灌酒停酒打击组根据打击后存活情况分为打击死亡组和打击存活组。慢性灌酒组连续灌酒4周、日两次间隔8h,前2周8ml/kg/次、后2周12ml/kg/次。2实验方法打击大鼠于最后一次灌胃2h或12h后,使用自制单摆行脑震荡性打击。打击死亡大鼠即刻开胸左心室取血约5ml,断头取脑并置于4%中性多聚甲醛。打击未死亡大鼠观察4h后同单纯组大鼠用乙醚麻醉后,开胸暴露心脏、左心室取血约5ml;经主动脉滴注4%中性多聚甲醛固定后,断头取脑并置于4%中性多聚甲醛固定。将脑组织制作石蜡切片,分别行HE染色观察及nNOS、HSP70免疫组织化学染色、血乙醇浓度检测。病理真彩色图像分析系统4.0病理学观测;Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量总积分光密度(SUM IOD)和平均积分光密度(MENA IOD);SPSS15.0 (Independent-samples T-test and One-way ANONA)及Excel 2003分析处理实验数据。结果1实验大鼠一般情况观察1.1灌酒一般状态急性组大鼠灌酒后早期兴奋性增强、好动、处于警觉状态,约0.5h后精神萎靡,步态不稳、迟缓,肌张力降低出现侧卧、昏睡、翻正反射消失、对刺激反应迟钝,血压降低,约6h逐渐恢复正常。慢性组大鼠出现进行性营养不良、胃肠功能紊乱、精神萎靡和活动减少等。1.2体重情况慢性组大鼠灌酒期间体重持续下降(P<0.01),其中第1w及第3w下降最显著。急性组大鼠体重呈缓慢增长(P>0.05),至第4 w增长较为明显(P<0.05)。1.3血压变化急慢性灌酒组大鼠尾动脉压(Caudal Arterial Blood Pressure, CABP)灌酒后2h的14.13±0.34 kPa较灌酒前0.5h的17.02±0.88 kPa显著降低(P<0.01);打击后4h与灌酒或水前0.5h血压差异不明显(P>0.05)。急性灌水组灌水前后血压无明显变化(P>0.05)。慢性灌酒组大鼠CABP自灌酒自第3w起明显升高持续至第4w达18.16±0.82 kPa比灌酒前的16.60±0.76 kPa升高明显(P<0.05)。1.4大鼠血乙醇浓度慢性灌酒打击存活组血乙醇浓度(Blood Alcohol Concentration, BAC)为60.08±13.80 mg/dL较急性灌酒打击组BAC为40.90±13.2 mg/dL高(P<0.05)。慢性灌酒打击死亡组BAC为215.63±26.71 mg/dL、慢性单纯灌酒组BAC为208.50±32.35 mg/dL,均比急性单纯灌酒组BAC的180.16±16.58 mg/dL高(P<0.05)。慢性灌酒停酒打击存活组BAC为16.43±8.20 mg/dL,急性单纯灌水组BAC为0。2实验大鼠TSAH发生和死亡情况急性灌水组未见TSAH发生和死亡,急性灌酒打击组TSAH发生率约28.6%,0-1级,死亡率0。慢性灌酒打击组TSAH发生率84.2%、0-3级,死亡率52.6%且死亡大鼠均发生TSAH、2-3级;慢性灌酒停酒打击组TSAH发生率约为71.4%、0-3级,死亡率为28.6%。综合本课题组前两届实验,慢性灌酒打击组死亡率比慢性灌酒停酒打击组、急性打击组高(P<0.05);TSAH发生率与慢性灌酒停酒打击组差异无显著性(P>0.05),但比急性打击组高(P<0.01)。3常规病理学观察3.1急性组大鼠病理学改变急性灌水组全脑未见TSAH及脑挫伤,表面呈蜡样苍白。HE未见暗神经元细胞,中央尼氏小体清晰,未见脑挫伤、出血等明显病变。急性单纯灌酒组额叶及小脑表面淤血,急性灌酒打击组部分发生轻微脑蛛网膜下腔出血(subarachnoid haemorrhage, SAH)。HE蛛网膜下腔薄层出血;血管空虚、部分淤血,实质细胞周隙轻度扩大;未见暗神经元细胞,中央尼氏小体清晰。3.2慢性组大鼠病理学改变慢性灌酒打击组大片较厚层SAH可累及全脑,以脑干腹侧面多见且重,未见脑挫伤;慢性单纯灌酒组额叶和小脑较大面积淤血。HE观察额叶、脑干、小脑蛛网膜下腔大片出血。额叶皮质各层神经元排列较疏松,细胞核轻度固缩,嗜酸性增强,多见噬神经现象;小脑蒲肯野细胞排列松散、外形不规则,呈三角形改变,突触不明显,细胞核固缩深染,结构不清晰。延脑可见多量核固缩、嗜酸性异染的神经元(暗神经元)。4免疫组化观察4.1实验大鼠脑组织nNOS表达情况急慢性组中脑总IOD值、平均IOD值均无明显差异(P>0.05)。慢性组额叶、延脑、小脑的总IOD值、平均IOD值均比急性组高(P<0.05)。慢性灌酒打击存活组额叶、延脑、小脑总IOD值和平均IOD值均比慢性灌酒打击死亡组、慢性灌酒停酒打击存活组、慢性单纯灌酒组高(P<0.01)。慢性灌酒打击死亡组、慢性灌酒停酒打击存活组及慢性单纯灌酒组之间总IOD值和平均IOD值无统计学意义(P>0.05)。急性灌酒组额叶、小脑、延脑总IOD值比急性灌水组高(P<0.01),但平均IOD值除小脑外无统计学意义(P>0.05);急性灌水组之间总IOD值和平均IOD值相比差异不明显,均无统计学意义(P>0.05),4.2实验大鼠脑组织HSP70表达情况慢性灌酒组HSP70总IOD值和平均IOD值均比急性组高(P<0.05)。慢性灌酒打击组存活组HSP70总IOD值和平均IOD值均比慢性灌酒打击组死亡组、慢性灌酒停酒打击存活组和慢性单纯灌酒组高(P<0.01);慢性灌酒打击死亡组HSP70总IOD值和平均IOD值比慢性灌酒停酒打击存活组低(P<0.01),与慢性单纯灌酒组相比差异无明显性(P>0.05);慢性灌酒停酒打击存活组HSP70总IOD值和平均IOD值比慢性单纯灌酒组高(P<0.01)。急性灌酒组之间大鼠延脑HSP70总IOD值和平均IOD值差异无明显性(P>0.05),但比急性灌水组高;且额叶、脑桥和小脑HSP70表达呈阴性。急性灌水组额叶、延脑、脑桥和小脑HSP70表达呈阴性。结论1.慢性酒精中毒与TSAH发生率、死亡率之间显著相关,提示长期酗酒情况下轻微头部脑震荡性打击导致的TSAH及其死亡案件,属于酒精慢性毒理学效应与外力等多因素综合作用的结果,应为偶然条件致命伤。2.慢性酒精中毒脑组织nNOS和HSP70表达均显著增强,可能是长期酗酒的中枢性毒理学作用的重要物质基础,构成TSAH高死亡率和死亡机制之一。