黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)是一类由土壤分离的革兰氏阴性细菌,具有区别于其他原核生物的复杂多细胞行为,如群体运动、形成子实体和抗逆性的粘孢子以及对外界大分子物质的捕食行为。依赖于鞭毛的滑动运动(Gliding motility)使粘细菌细胞可以沿长轴方向运动,粘细菌的滑动运动由A (adventurous)运动和S (social)运动两个相互独立的系统组成。A运动系统中,细胞可以独立的运动；S运动系统则依赖于细胞间的相互接触,细胞可以共同的运动。粘细菌特殊的滑动运动与铜绿假单胞菌和淋病柰瑟氏菌的颤搐运动(Twiching motility)具有一定的相似性。黄色粘球菌的S运动研究显示,S运动受到四型菌毛(Type Ⅳ pili, TFP)、胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)和脂多糖O-抗原的共同调控作用。研究发现,TFP周期性的伸长和收缩介导S运动的进行,且该过程依赖于TFP和EPS的相互作用。作为S运动的器官,TFP由数千个pilin (PilA)亚单位呈螺旋状排列构成。TFP在细胞一端聚集,伸长并粘附在介质或相邻细胞的表面,收缩拉动细胞运动。EPS是S运动中的另一关键组分,为TFP提供粘附的位点,EPS对于粘球菌生物膜骨架和子实体形成、细胞间的聚集及细胞与介质粘附作用等具有重要的作用。目前关于TFP与EPS间特异性的相互作用曾被提出,并研究出一些自然状态下两个分子相互作用的证据,但对于TFP和EPS之间具体的作用机制以及定量的分析一直是研究的难点。本文采用实时和非生物标记的研究方法,定量的对PilA蛋白和EPS特异性的识别和结合过程进行分析,以此阐明TFP与EPS特异性相互作用的分子机制。本文第二章,详细的描述了黄色粘球菌PilA蛋白的异源表达和EPS的分离纯化过程。由于PilA蛋白较差的水溶性,全长的PilA蛋白很难在体外大量的可溶性表达。基于前期的实验研究和生物信息学分析,我们构建了含有截短的PilA蛋白的异源表达质粒,截短的PilA蛋白只含有C-端的结构域(含32-208位氨基酸),体外实验证实了截短的PilA蛋白与野生型PilA蛋白具有相同的EPS结合能力。同时,通过大平板培养黄色粘球菌DK1622,分离纯化了得到EPS样品。利用气相色谱／质谱联用(GC/MS)方法,对纯化的EPS进行组分分析,结果发现EPS是一类复杂的混合多糖,由不同比例的葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、葡萄糖胺、N-乙酰-葡萄糖胺和N-乙酰-甘露糖胺等组分构成。本文第三章,主要介绍了利用非标记的生物物理技术,如表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR)和等温量热滴定(isothermal titration calorimetry,ITC)技术,利用GC/MS分析并确认存在于粘球菌EPS组分中的某些单糖与PilA蛋白的相互作用情况,并以此分析两个分子结合过程中的动力学和热力学数据。实验结果显示,在EPS的所有糖组分中,葡萄糖胺可以与PilA蛋白发生特异性的相互作用,据此猜测TFP可能识别葡萄糖胺作为结合位点。另外,壳聚糖是由葡萄糖胺和N-乙酰-葡萄糖胺组成的多聚糖,与PilA蛋白可以发生明显的相互作用,并且结合作用的强度随着壳聚糖分子量的增加而呈现减小的趋势。在糖竞争作用实验中,葡萄糖胺可以抑制与壳聚糖的与PilA蛋白的结合作用,这可能与葡萄糖胺和壳聚糖与PilA蛋白有着相同的作用位点有关。本文第四章,期望通过多种生物信息学方法,分析得到PilA蛋白上与EPS相互作用的关键位点信息。通过分析,预测得到22个可能的与多糖发生结合作用位点。壳聚糖可以替代EPS行使其在S运动中的功能,在22个预测的作用位点中,由几丁质酶的识别葡萄糖胺的位点预测的146位和181位的色氨酸残基,是两个关键位点。通过点特异性突变,将两个位点的色氨酸残基(W)分别突变成了丙氨酸残基(A),并分离纯化得到了突变的PilA蛋白。但是,ITC实验结果显示,两个突变的PilA蛋白与葡萄糖胺和壳聚糖的滴定结果与野生型的PilA蛋白相似。说明146位和181位的色氨酸残基对于PilA与EPS的结合并没有很大的影响,目前对其他20个预测位点进行相应分析和验证工作。