当归,为伞形科多年生草本植物Angelica sinesis (Oliv.) Diels的干燥根,主要产地为我国甘肃岷县。在传统中医药中,当归作为补血活血及调经止痛的要药被广泛使用。当归多糖(Angelica Polysaccharide)是从当归根中提取出的一种水溶性多糖,也是当归的主要活性成分之一。近年来的研究表明,当归多糖有着显著的补血补铁及促进机体免疫的作用,同时也对保护肝功能有着独特的疗效,但其作用机理尚不明确。以当归的干燥根部为原料,采用水提醇沉法提取粗多糖,并经纯化得到精制当归多糖ASP。通过化学及光谱图谱对所得产物的纯度和初级结构进行分析。用荧光物质标记ASP,考察其在大鼠肝脏组织的分布情况、不同浓度下的分子粒径大小及对Toll样受体和甘露糖受体的结合作用,探讨ASP对肝脏的靶向作用。建立刀豆蛋白致肝损伤及酒精性肝损伤两种急性肝损伤模型,通过体内及体外实验考察ASP对急性肝损伤的保护作用及机制,为增加ASP的临床应用范围及药效机制提供实验和理论基础。第一部分 当归多糖的肝靶向作用研究采用传统的水提醇沉法从当归饮片中提取粗多糖,并通过反复冻融、微孔滤膜过滤法及Sephadex G-50色谱层析柱分离纯化,得到白色絮状固体ASP。紫外可见光光谱显示ASP不含核酸和蛋白质,由红外光谱所示特征吸收峰推测ASP为β-D吡喃糖,苯酚-硫酸法测定其糖含量为90.25%,高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定其重均分子量(Mw)为9.4×104Da。ASP经FITC标记后得橙黄色絮状标记产物(FITC-ASP, FA)。FA产率稳定,在紫外可见光及荧光扫描图谱中可见典型的荧光素FITC的特征吸收峰,并且在PBS溶液及血浆中稳定性较好,荧光标记取代度适宜,可成为研究当归多糖肝靶向作用的工具。体内分布实验采用四种浓度剂量(3、6、12及24mg/kg)的FA经尾静脉注射SD大鼠,在给药0.25、0.5、1、1.5、2、3和4 h时采用高效液相色谱仪检测肝脏匀浆液的荧光强度。结果显示,给药后FA迅速分布到肝脏组织并蓄积,至约1.5 h左右达到峰值。随后,肝脏组织中FA的浓度逐渐下降,至4h后基本从肝脏组织中清除。原子力显微镜和布鲁克海文粒度仪实验结果表明,ASP的浓度为1μg/mL至20mg/mL时,ASP在溶液中分散均匀,稳定性较好,其粒径在200nm到3μm之间,在肝脏的被动靶向粒径范围内,可被肝巨噬细胞(Kupffer细胞)摄取而聚集于肝脏组织,产生被动靶向肝脏的作用。Kupffer细胞TLR4及甘露糖受体的体外拮抗实验证实,Kupffer细胞可以通过甘露糖受体与当归多糖ASP产生特异性结合作用,而Kupffer细胞上的TLR4与ASP并没有明显的结合作用。上述结果表明,ASP可通过与甘露糖受体结合产生部分主动肝靶向作用,为后续当归多糖对急性肝损伤保护作用的研究提供实验思路及理论基础。第二部分当归多糖对刀豆蛋白致急性肝损伤小鼠肝保护作用机理研究体内实验采用刀豆蛋白诱导急性肝损伤模型：将小鼠随机分组,低剂量给药组小鼠每日单次尾静脉注射ASP 1.5 mg/kg;高剂量给药组及ASP毒性试验组小鼠每日单次尾静脉注射ASP 6 mg/kg;正常对照组及模型组小鼠每日单次尾静脉注射等体积PBS。连续给药14天,于第15天诱导损伤,即模型组及低、高剂量给药组小鼠单次尾静脉注射ConA 15 mg/kg;正常对照组及ASP毒性试验小鼠单次尾静脉注射等体积0.01 M PBS。造模8 h后采用眶动静脉取血法采集血液。造模20 h后称量并记录小鼠体重,处死小鼠后取出肝脏组织,均分并分别采用多聚甲醛固定及-80℃冷冻处理。通过观察肝脏表观形态、苏木精-伊红染色切片显微图片及计算各组小鼠肝指数和转氨酶水平考察ASP对刀豆蛋白致急性肝损伤的保护作用。观察肝脏表观形态可见,造模后小鼠肝脏颜色发黑变暗,有严重的血液淤积现象；低、高剂量给药组小鼠肝脏颜色较模型组均有所恢复。由苏木精-伊红染色图片可以观察到,ConA致急性肝损伤模型建立后,小鼠肝脏组织出现大面积坏死、细胞核固缩、细胞破碎,汇管区及肝实质内有严重的炎性细胞浸润；相比于模型组,低、高剂量给药组小鼠肝脏细胞形态趋于完整,无明显的坏死区域,汇管区和肝实质内炎性细胞数量明显减少。计算肝指数发现,与正常对照组相比,ConA模型组小鼠肝指数从4.32%上升为6.08%,而经ASP预给药的两组小鼠肝指数较ConA模型组均明显降低。血清转氨酶检测结果发现,ConA模型组小鼠血清AST及ALT较正常对照组小鼠显著上升了近千倍,而低、高剂量给药组小鼠血清AST及ALT水平较ConA模型组均有极显著降低。以上结果表明,ASP对刀豆蛋白致急性肝损伤有良好的肝保护作用。ASP毒性试验组小鼠各指标与正常对照组相比并没有显著改变,证实在实验设计的剂量浓度下ASP对小鼠无毒副作用。采用检测试剂盒和双抗体夹心ELISA法探究ASP对模型小鼠血清细胞因子(TNF-α, IFN-γ, IL-2和IL-6)及抗氧化相关指标(SOD. ROS和MDA)的影响。由结果可知,ConA模型组小鼠血清免疫相关细胞因子TNF-α, IFN-γ, IL-2和IL-6与正常对照组相比显著升高,体内ROS及MDA水平均异常增加,而SOD酶活力明显降低；与ConA模型组相比,低、高剂量组小鼠TNF-α, IFN-γ, IL-2和IL-6水平均有显著降低,体内ROS及MDA水平明显下降,而SOD酶活力显著增加。上述结果显示,预给药ASP能够有效地抑制刀豆蛋白引起的机体免疫炎性及氧化应激反应,提高抗氧化能力,从而减轻刀豆蛋白诱导的肝损伤。采用蛋白质印迹法检测ASP对刀豆蛋白致急性肝损伤小鼠肝脏组织中各通路关键蛋白表达的影响。实验结果显示,相比于ConA模型组,低、高剂量组小鼠肝脏组织中 NF-κB、IKKα、p-IκBα、Caspase-3、Caspase-8、cleaved Caspase-8、p-JNK、Bax、 STAT3、p-STAT3、TLR4和TNFR1的表达水平明显降低,Bcl-2的水平显著升高,但p-Akt的表达量并没有显著差异。由上述结果推测,ASP可能通过以下途径减轻刀豆蛋白诱导的急性肝损伤：(1)减少氧化应激及细胞因子的释放,抑制TNFR1和其配体结合及下游MAPK/JNK和Caspase家族信号通路,一方面阻碍JNK磷酸化及其诱导的Bax活化,减轻线粒体损伤：另一方面抑制Caspase家族级联信号通路激活,减少Caspase-8活性片段的产生,减弱Bax的促凋亡作用。同时,Bax和Caspase-8水平的下降均可以下调Caspase-3的表达,阻碍肝细胞核小体间的DNA裂解和细胞程序性死亡,从而抑制肝细胞的损伤及坏死。(2)抑制TLR4和TNFR1的激活,减少IKKa亚基被磷酸化,从而下调IKK的表达。未活化的IKK不能使IκBα被磷酸化而停留在静息状态,与NF-κB p65/p50亚单位以失活状态存在于细胞质中,阻碍NF-κB活化进入细胞核,从而降低炎性细胞因子的转录水平,减少细胞因子的释放以及肝脏细胞的凋亡坏死。(3)抑制IL-6/STAT3信号通路的过度激活,降低STAT3的磷酸化水平,减少粒细胞和淋巴细胞增殖及细胞因子的大量分泌；同时减少肝细胞分泌急性期反应蛋白,缓解肝细胞损伤坏死。体外实验研究ASP对刀豆蛋白诱导的淋巴细胞体外增殖作用及其对HepG2和HT 29肿瘤细胞的直接细胞毒性作用的影响。将提取的脾总细胞用CFSE标记后分孔刺激,即空白对照孔加入等体积1640完全培养基,ConA模型孔加入ConA(终浓度5μg/mL),ASP给药孔加入ASP(终浓度25μg/mL)和ConA(终浓度5μg/mL),于培养箱中培养72 h后加入混合的荧光标记抗小鼠单抗(PE-Cy7 anti-CD3ε、APC anti-CD4和PE anti-CD19),用流式细胞仪检测细胞增殖。增殖结果表明,ConA可促进CD4+T淋巴细胞和非CD4 T淋巴细胞的增殖,而对B淋巴细胞没有明显作用;ASP给药孔CD4+T淋巴细胞和非CD4 T淋巴细胞的增值指数及百分增殖率均较ConA模型孔有显著降低,而B淋巴细胞增殖现象明显。采用MTT实验考察在刀豆蛋白损害过程中ASP对细胞的直接保护作用。结果表明,相比于ConA模型孔,实验浓度的ASP(10、100和1000 μg/mL)给药后对HepG和HT 29肿瘤细胞的增殖并没有显著变化,推测ASP并不是通过直接作用于被损害细胞而发挥肝保护作用。第三部分当归多糖对急性酒精性肝损伤小鼠肝保护作用机理研究体内实验采用酒精诱导急性肝损伤模型：将小鼠随机分组,低剂量给药组小鼠每日单次尾静脉注射ASP 1.5 mg/kg;高剂量给药组小鼠每日单次尾静脉注射ASP 6 mg/kg;正常对照组及模型组小鼠每日单次尾静脉注射等体积PBS。连续给药14天,于第15天诱导损伤,即模型组及低、高剂量给药组小鼠每次灌胃5mL/kg50%酒精溶液,共灌胃三次,间隔1 h;正常对照组小鼠每次灌胃等体积超纯水,共灌胃三次,间隔1h。灌胃后禁食。造模6 h后采集采用眶动静脉取血法收集血液。造模12 h后称量并记录小鼠体重,处死小鼠后取出肝脏组织,均分并分别采用多聚甲醛固定及-80℃冷冻处理。通过观察苏木精-伊红染色切片显微图片及计算各组小鼠肝指数和转氨酶水平考察ASP对酒精致急性肝损伤的保护作用。由苏木精-伊红染色图片可以观察到,与正常对照组相比,酒精模型组小鼠肝脏实质内弥散出现大量炎性细胞及细胞空洞；低剂量给药组小鼠肝脏切片比模型组稍有好转,而高剂量给药组小鼠肝脏细胞形态趋于完整,无明显的细胞空洞,细胞核染色正常,炎性细胞浸润现象消失。计算肝指数发现,酒精造模后小鼠肝指数显著上升,而低、高剂量给药组小鼠肝指数与模型组相比均明显降低。由血清转氨酶实验结果可知,低、高剂量给药组小鼠血清AST及ALT水平较酒精模型组均有显著下降,其ALT平均水平甚至低于正常组小鼠。以上结果初步表明,ASP对酒精诱导的急性肝损伤有良好的肝保护作用。采用检测试剂盒和双抗体夹心ELISA法探究ASP对模型小鼠体内细胞因子(TNF-α, IFN-γ和IL-6)、内毒素LPS及抗氧化相关指标(SOD、CAT、GR、GSH-Px、 GSH、ROS和MDA)的影响。由结果可知,酒精模型组小鼠血清及肝脏组织中TNF-α和IFN-γ以及肝脏组织中IL-6水平显著高于正常对照组,但血清IL-6水平没有较明显的改变;相比于模型组,低、高剂量给药组小鼠血清及肝脏组织中TNF-α和IFN-γ明显下降,高剂量给药组肝脏组织中IL-6水平显著低于模型组,但血清IL-6水平没有较明显的改变。酒精造模后,小鼠血清内毒素水平较正常对照组显著性增高,出现内毒素血症;低、高剂量给药组小鼠血清内毒素水平明显低于模型组,内毒素血症得到缓解。低、高剂量组小鼠肝脏SOD、CAT、GR和GSH-Px等酶的活力及GSH水平相比酒精模型组显著提高,而ROS和MDA的水平显著下降。由上述结果推断,预给药ASP能够有效地抑制酒精引起的机体免疫炎性及氧化应激反应,提高抗氧化能力,从而减轻酒精诱导的急性肝损伤。为进一步探究ASP对酒精诱导的氧化应激及脂质过氧化反应的影响,采用流式细胞术及荧光显微成像研究ASP对HepG2细胞中ROS水平的影响；测定ASP对DPPH自由基的清除能力；试剂盒检测小鼠血清及肝脏TG浓度：油红0染色法观察各组小鼠肝脏组织以及药物干预后各孔HepG2细胞的油红O染色显微图片。流式细胞术及显微图片结果表明,相比于模型组,各剂量给药组ASP显著抑制酒精诱导的HepG2细胞ROS水平的升高。ASP对DPPH 自由基的清除能力的实验结果显示,ASP在1-20 mg/mL的浓度范围内对DPPH自由基具有良好的清除作用,而ASP浓度为20mg/mL时,其清除率接近100%。TG检测结果显示,低、高剂量给药组小鼠血清及肝脏TG浓度较模型组均有显著性降低。油红O染色显微图片可见,酒精模型组小鼠肝脏弥散大量橘红色油脂,低剂量给药组小鼠肝脏橘红色脂滴数量比酒精模型组有所减少,而高剂量给药组小鼠肝脏与正常对照组相似,油红O切片中极少见到大片橘红色油脂；酒精模型孔HepG2细胞周围弥散大量粘附的橘红色油脂,各浓度实验孔橘红色脂滴数量比酒精模型孔明显减少,只有零星橘红色油脂。由上述结果推测,ASP能够有效抑制酒精诱导的氧化应激及脂质过氧化反应,减轻急性酒精性肝损伤。体外实验以HepG2细胞为对象,采用MTT法研究ASP对酒精的直接细胞毒性的影响。由MTT实验结果可知,随着酒精浓度的增加,酒精对HepG2细胞的生长抑制现象越来越明显,呈浓度依赖关系,且当酒精浓度高于200mM时,HepG2细胞的生长抑制率超过50%。与酒精对照组相比,各浓度的ASP可以较好地对抗酒精产生的抑制HepG2细胞生长的作用,且当ASP浓度大于50 μg/mL时,其对各实验浓度酒精的细胞毒性均有较好的抑制作用,且呈现良好的浓度依赖关系。由此可知,当归多糖对酒精的直接细胞毒性有良好的抑制效果,阻碍酒精介导的细胞死亡。体外实验用药物干预各孔HepG2细胞后抽提细胞蛋白、体内实验提取各组小鼠肝脏组织总蛋白,采用蛋白质印迹法检测生物样本中各通路关键蛋白的表达。结果显示,低、高剂量组小鼠肝脏组织和酒精诱导的HepG2细胞中Caspase-3、Bax、TLR4和CYP2E1的表达水平与酒精模型组相比均有显著性降低,Bcl-2的表达水平显著性增加。低、高剂量给药组小鼠肝脏组织中NF-κB和p-IκBα的表达水平较模型组有显著下降,但HepG2细胞中NF-κB和p-IκB。的表达水平与酒精模型孔没有显著性差异。由此分析,当归多糖可能通过以下途径减轻酒精诱导的急性肝损伤：(1)减少Bax并增加Bcl-2的表达,下调Bax/Bcl-2的比值,抑制酒精诱导的线粒体凋亡信号通路；同时抑制Caspase家族级联信号通路激活,减少Caspase-3的活化,阻断肝细胞核小体间的DNA裂解和细胞程序性死亡,从而减轻肝细胞的损伤及坏死。(2)通过调节TLR4的过度激活而抑制NF-κB信号通路,阻止IκBα被磷酸化而停留在静息状态,与NF-κB p65/p50亚单位以失活状态存在于细胞质中,阻碍NF-κB解聚活化后进入细胞核内,从而抑制NF-κB依赖的炎性细胞因子相关基因转录,减少细胞因子的释放以及肝脏细胞的损伤坏死。(3)抑制酒精诱导的CYP2E1异常升高,减少其催化的代谢产物ROS的大量产生,下调体内氧化应激水平而减轻肝脏损伤及坏死。