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目的:检测临床分离鲍曼不动杆菌中携带的β-内酰胺酶基因及外排泵基因,体外诱导鲍曼不动杆菌对多粘菌素B产生耐药,以探讨其对多粘菌素B的耐药机制。方法:1、连续收集西南医科大学附属医院临床分离的63株非重复多重耐药鲍曼不动杆菌,采用微量肉汤稀释法测定亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、头孢吡肟、左氧氟沙星、环丙沙星、阿米卡星、多粘菌素B及头孢哌酮舒巴坦的最低抑菌浓度(MICs)。2、采用肠杆菌科基因间重复序列-聚合酶链反应(ERIC-PCR)获得63株鲍曼不动杆菌的指纹图谱并进行同源性分析。3、采用聚合酶链反应(PCR)检测β-内酰胺酶基因TEM、AmpC、OXA-23、KPC、IMP、VIM,外排泵基因adeB、adeG、adeJ、adeR、adeS,两组份调节系统基因pmrA、pmr B。4、采用体外实验对收集的菌株进行诱导耐药,以获得多粘菌素B耐药的鲍曼不动杆菌。5、采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测诱导耐药菌株及原始敏感菌株的外排泵基因adeB、adeJ、adeG及两组份调节系统基因pmrA、pmr B的m RNA表达情况,分析其表达差异。6、对负责脂质A生物合成的基因lpxA/lpxC/lpxD及两组份调节系统基因pmr A、pmrB进行PCR扩增并将扩增产物测序,探讨耐药菌株是否发生特异性突变。7.采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对诱导耐药的菌株及原始敏感菌株进行检测,分析其蛋白质差异。结果:1、63株鲍曼不动杆菌对多粘菌素B全部敏感,对亚胺培南、美罗培南、环丙沙星及阿米卡星的耐药率为100%,对头孢他啶的耐药率为92%,对头孢吡肟的耐药率为97%,对头孢哌酮舒巴坦的耐药率为43%。2、63株鲍曼不动杆菌经过ERIC-PCR检测共分为5型,主要为A型58株(A1型26株,A2型32株)、B型2株,C、D、E各为1株,主要来自于ICU及呼吸内科。3、在临床分离的63株鲍曼不动杆菌中,有50株产TEM型β-内酰胺酶,58株产AmpC酶,62株产OXA-23型碳青霉烯酶,未发现产KPC、IMP、VIM的菌株。此外63株鲍曼不动杆菌中携带外排泵基因adeB、adeJ、adeG、adeR、adeS的分别为61、62、62、60、60株,携带pmrA、pmrB基因的分别为61及59株。4、对33株多粘菌素B敏感的鲍曼不动杆菌进行体外诱导耐药试验,共获得了18株多粘菌素B耐药的鲍曼不动杆菌,其对多粘菌素B的MIC值从0.5g/ml上升到256g/ml,而其他抗生素的MIC值均未发生明显改变。5、通过RT-qPCR检测发现诱导耐药菌株与原始敏感菌株之间外排泵基因adeB、adeG、adeJ的mRNA表达量并无明显差异(P值分别为0.586、0.983、0.948),两组份调节系统基因Pmr A在耐药菌株存在高表达(p=0.014),而PmrB基因在耐药菌株与敏感菌株中表达无明显差异(p=0.472)。6、对脂质A生物合成的基因lpxA/lpxC/lpxD测序发现,耐药菌株的脂质A合成基因lpxC在2649454位碱基发生突变(GAA→AAA),导致编码的谷氨酸变为赖氨酸,而两组份调节系统基因则未发现特异性突变。7、通过对多粘菌素B耐药菌株及敏感菌株进行MALDI-TOF MS检测分析发现,耐药菌株在5177 Da与6093 Da出现特异的峰值增强现象,而在8049 Da处则出现特异的峰值减弱。结论:1、鲍曼不动杆菌对常用抗生素有较高的耐药率,对于多粘菌素B则全部敏感。2、鲍曼不动杆菌对常用抗生素的耐药与产生β-内酰胺酶及外排泵的表达有关。3、通过体外诱导的方法能够得到多粘菌素B耐药的鲍曼不动杆菌,其对多粘菌素B的耐药机制与两组份调节系统的pmr AB的高表达及LPS编码基因lpxC的突变有关。