论文部分内容阅读
植物真菌病害在植物病害中发生程度最高，最常见，约占病害的80％，生物防治是不污染环境，对人和其它生物安全，是农药等非生物防治方法所不能比的。为了深入研究生物防治菌棘孢木霉（Trichoderma asperellum）ACCC30536菌株刺激植物响应蛋白Epl1的功能，基于转录组测序得到的刺激植物响应蛋白基因Epl1部分cDNA序列设计引物，分别以棘孢木霉ACCC30536菌株菌丝体总mRNA和基因组DNA为模板，进行PCR扩增，克隆获得Epl1的全长cDNA和DNA序列，其GenBank接受号分别为HM572232和JF970203，cDNA序列全长为690bp，编码139个氨基酸。BlastP相似性分析表明该基因氨基酸序列与深色木霉（T.atroviride）Epl1(CAL80754)同源性最高为92％，SignalP信号肽分析表明N端第18和19个氨基酸中间有一个信号肽剪切位点(VSA//DT)。Pfam蛋白家族分析表明它属于cerato-platanin superfamily家族。 将棘孢木霉ACCC30536菌株刺激植物响应蛋白Epl1对深绿木霉ATCC74058（T.atroviride ATCC74058）基因组，绿色木霉Gv29-8（T.virens Gv29-8）基因组，哈茨木霉CBS226.95（T.harzianum CBS226.95）基因组，棘孢木霉CBS433.97(T.asperellum CBS433.97)基因组进行同源性搜索，在4个近源种的基因组上前3个近源种基因组分别获得3个同源序列，棘孢木霉CBS433.97获得5个同源序列。其中，棘孢木霉CBS433.97 EPL1-Tas氨基酸序列与棘孢木霉刺激植物响应蛋白Epl1相似性最高达到91％，该序列位于棘孢木霉CBS433.97染色体骨架7上。 运用实时荧光定量PCR方法，检测8种不同的培养条件诱导的棘孢木霉刺激响应蛋白Epl1基因在转录水平上的变化，发现MM、N饥饿1％山新杨组培苗根粉诱导条件抑制Epl1基因的表达，分别在4、72、4h达到最大抑制，分别抑制到未诱导前的12.97、10.82、31.91倍。在C饥饿、1％山新杨组培苗茎粉、1％山新杨组培苗叶粉、1％杨树叶枯病菌(Alternaria alternata，poplar leaf wither)细胞壁和5％杨树叶枯病菌(A.alternata，poplar leaf wither)发酵液诱导条件下，刺激植物响应蛋白基因大部分时间表现为上调表达，分别在第72、12、8、72、72h时表达量达到高峰，最大达到未诱导时的7.15、373.56、45.00、75.57、149.92倍。 将克隆获得的Epl1基因构建原核表达载体pGEX-Epl1，转化大肠杆菌获得Epl1基因原核表达基因工程菌株BL21-TasEpl1。通过IPTG诱导使Epl1基因在大肠杆菌BL21中表达，SDS-PAGE检测得到40.5kDa大小的蛋白条带，与预期一致，证明基因在大肠杆菌中大量表达。 总之，Epl1基因的克隆为研究棘孢木霉刺激植物响应蛋白Epl1三维结构、功能、蛋白学特性提供了基础数据;也为进一步研究重组Epl1蛋白诱导杨树的抗病能力提供技术支持;同时为重组Epl1蛋白生物农药的研制奠定良好物质基础。