视网膜变性性疾病是一类主要的致盲性眼病，到目前为止发病机制尚不十分明确，因此缺乏理想的治疗措施。研究表明光感受器细胞凋亡是它们共同的病理通路。 银杏内酯B是银杏叶提取物中的有效成分，具有神经元保护和抗细胞凋亡的作用，其在中枢神经系统变性性疾病和缺血缺氧病变中的作用已经得到公认。但是由于难溶于水，体内生物利用度低，限制了其在临床的应用，目前国内、外都没有成品药物上市。本课题研制银杏内酯B的自微乳化释药系统，以期提高它的生物利用度，进而提高其在视网膜中的药物浓度：同时建立MNU诱导的视网膜感光细胞凋亡模型，探讨银杏内酯B自微乳制剂对感光细胞的保护作用，并初步探讨其作用机制，为视网膜变性性疾病提供有效的治疗途径，并进一步促进中药现代化。 本研究共分为三部分： 第一部分银杏内酯B拮抗体外培养的SD大鼠视网膜神经细胞凋亡的作用 目的：探讨银杏内酯B(ginkgolideB，GB)对谷氨酸诱导的新生大鼠视网膜神经细胞凋亡的拮抗作用及可能的机制。 方法：采用酶消化法原代培养SD大鼠视网膜神经细胞，建立合适的谷氨酸诱导视网膜神经细胞凋亡模型。MTT法检测不同浓度的银杏内酯B对谷氨酸诱导的视网膜神经细胞存活率的影响。流式细胞仪联合AnnexinV/PI检测细胞凋亡率，流式细胞仪联合JC-1检测线粒体膜电位变化。 结果：100μM谷氨酸作用12h后，视网膜神经细胞存活率降低至58％，细胞凋亡率达到52.4％，JC-1检测的红/绿比值下降。预先给予不同浓度(10-100μM)的银杏内酯B后，神经细胞存活率增加，凋亡率降低，线粒体膜电位提高。在10-100μM范围内其作用有剂量依赖性。 结论：银杏内酯B可以剂量依赖性的拮抗谷氨酸诱导的视网膜神经细胞的凋亡，其作用机制可能与提高线粒体膜电位有关。 第二部分银杏内酯B自微乳化释药系统的处方研究和在SD大鼠视网膜分布的药代动力学研究 目的：制备银杏内酯B白微乳化制剂(self-microemulsifyingdrugdeliverysystems，SMEDDS)并对其进行质量评价，同时考察口服后SD大鼠视网膜内的药代动力学指标。 方法：通过高效液相-电喷雾-质谱(HPLC-ESI-MS)方法测定银杏内酯B在不同油相、表面活性剂、助表面活性剂中的溶解度，结合伪三元相图，筛选银杏内酯B自微乳化制剂的处方。考察药物含量和分散介质对制剂稳定性的影响，考察该制剂经0.1NHCI稀释后形成微乳的形态、粒径和成乳稳定性。以普通银杏内酯B混悬液为对照，观察口服40mg/kg银杏内酯B自微乳化制剂后SD大鼠视网膜内药代动力学指标。 结果：自微乳化介质处方为油酸乙酯-(CremophorEL/大豆磷脂/无水乙醇)(40:60，w/w)，其中CremophorEL/大豆磷脂/无水乙醇(4:1:2)，GB的载药量为2.5％。乳化介质(H2O和0.1NHCl)对制剂自微乳化效率影响不大。银杏内酯B自微乳制剂经0.1NHCl稀释100倍后透射电镜下呈圆球形，分布均匀，粒径为41.6±1.11nm，自微乳化时间大约在2分钟。8h内制剂稳定，粒径变化不大，无药物析出。SD大鼠分别口服40mg/kgGB-SMEDDS和等量GB混悬液后，峰浓度(Cmax)分别为15.83±1.84ng/ml和2.65±0.10ng/ml，药物浓度曲线下面积(AUC0-∞)分别为15.30±0.11ng/mg.h和6.42±0.19ng/mg.h。 结论：银杏内酯B自微乳化制剂制备简单，质量稳定，可以显著提高药物在SD大鼠视网膜内的含量。 第三部分银杏内酯B自微乳化给药系统拮抗MNU诱导的视网膜感光细胞凋亡及机制研究 目的：探讨银杏内酯B自微乳化制剂对N-甲基-N-亚硝脲(N-methyl-N-nitrosourea，MNU)诱导的视网膜感光细胞凋亡的治疗作用及可能的作用机制。 方法：生后45天的SD大鼠105只，随机分为：正常对照组、模型对照组、低剂量GB治疗组(40mg/kg)、中剂量GB治疗组(80mg/kg)、高剂量GB治疗组(120mg/kg)。GB治疗组于生后45天开始用GB-SMEDDS灌胃给药，模型对照组给等量生理盐水灌胃，每日三次，连续灌服6日。模型组和GB治疗组于生后第50天一次性腹腔注射MNU40mg/kg，建立大鼠视网膜变性模型。各组每次5只分别于腹腔注射MNU后24h、48h、3d、5d、7d做视网膜电图，继而处死动物，各组取右眼球做病理切片，测量中心视网膜外层厚度(外核层和光感受器细胞层)；TUNEL法检测光感受器细胞凋亡。正常对照组、模型组和低剂量GB治疗组分别取左眼视网膜提取RNA，RF-PCR检测各组Bcl-xl和Bax表达量变化。 结果：模型组注射MNU后F-ERGa、b波振幅明显下降，第3天时呈熄灭型。给予不同剂量的GB-SMEDDS灌胃后a、b波振幅均比同时间点的模型组高(P<0.05)；建模后7天，治疗组间ERGa、b波振幅相互比较有统计学差异(P<0.05)。治疗组中心视网膜外层厚度与对应时间点的模型组相比明显增厚(P<0.05)。到建模第七天时，各治疗组间视网膜外层厚度相互比较有统计学差异(P<0.05)：给予GB-SMEDDS治疗后，TUNEL检查细胞凋亡指数与相应时间点的模型组相比明显减少(P<0.05)。MNU腹腔注射后1dRT-PCR检测视网膜中Bcl-xlmRNA的表达迅速降低，到第3d降至最低，此后逐渐上升但是仍低于正常对照；而BaxmRNA的表达量在1d时达到高峰，此后表达量下降，但是总体趋势仍高于正常；Bcl-xl/Bax比值远远低于正常对照组。GB-SMEDDS治疗组在相应时间点Bel-xl的表达量高于MNU模型组，而Bax的表达量则明显低于模型组，Bcl-xl/Bax比值较模型组显著升高。 结论：银杏内酯B自微乳释药系统能剂量依赖性地抑制MNU诱导的光感受器细胞凋亡，其作用机制可能与上调Bcl-xl表达量，降低Bax的表达，提高Bcl-xl/Bax比值有关。