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目的:周围神经损伤是临床上常见疾病,周围神经损伤的显微外科修复技术已经十分精湛,却长期以来难以获得满意结果。随着分子生物学和基因转移技术不断进步,神经损伤的基因治疗研究正在兴起。应用复制缺陷型重组腺病毒(Adenovirus,AdV)为载体将各种神经营养因子基因转入脊髓以保护受损的神经元和促进周围神经再生的研究,已成为神经修复研究领域的前沿课题。基因治疗的效果依赖于将目的基因特异、高效和安全的转染受损神经元及神经并高效表达,但由于宿主对病毒载体的免疫反应,使导入的基因不能在体内长时间高水平表达,从而限制了导入基因的治疗作用的发挥。此技术最终应用于人类,而人类大部分在一生开始的几年中被野生型的腺病毒感染。因此,在相当多的应用腺病毒载体的基因治疗的临床应用中,为了分析和控制对载体得免疫反应用病毒预先致敏动物是非常重要的。本实验为了提高腺病毒介导的基因表达,将携带LacZ基因的AdV (AdLacZ)与不带外源基因的Ad0或与携带有细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4immunoglobulin , CTLA4Ig )基因的AdV (AdCTLA4Ig)两种腺病毒混悬液通过微量注射导入已被腺病毒致敏的大鼠腰膨大脊髓实质内,比较共同转染AdCTLA4Ig后β-gal在脊髓表达水平变化;并通过对大鼠血清抗病毒抗体和中和抗体滴度检测,以探讨CTLA4Ig诱导机体对AdLacZ的免疫耐受的作用及其机理。方法:选用7周龄健康雌性Wister大鼠120只,体重200～250g。将大鼠随机分成两组,每组60只。在往大鼠脊髓注射病毒之前7天,在胸背侧皮下注射AdLacZ进行预处理。对照组(A组)导入AdlacZ+Ad0,实验组(B组)导入AdlacZ+AdCTLA4Ig。将大鼠经腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻醉(75-100mg/kg+5mg/kg),麻醉成功后固定于脑立体定位仪上。取长约3cm后正中切口,去除T13椎板暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-III型手动推进器,于脊髓后正中动脉右侧1mm处注射AdlacZ(1×109pfu/ml)和Ad0(5×109pfu/ml)各1μl(A组)或AdLacZ(1×109 pfu/ml)和AdCTLA4Ig(5×109 pfu/ml)各1μl(B组)。针尖向头侧呈45度斜行进针,斜行刺入深度为2.5mm。注射速度为1μl/min,注射完毕后滞针5min,缓慢拔针。充分止血、冲洗伤口,局部喷洒抗生素预防感染,关闭伤口。两组在转染病毒后5个不同的时间点大鼠心脏取血3.5ml;在转染后5个不同时间点,对两组动物脊髓进行厚50μm的连续冰冻横切片,计数A组与B组中X-gal染色阳性的切片数,分析比较两组LacZ基因在脊髓表达的高峰期和持续时间;并检测血清抗病毒中和抗体滴度;用多聚酶链式反应(PCR)检测腺病毒注入后在血中消失时间。结果:1 X-gal, CTLA4Ig转基因表达:LacZ基因和CTLA4Ig基因转染脊髓双侧的前角运动细胞和周围的胶质细胞。转基因表达范围局限于注射点上下各0.5cm区段,表达高峰时有转基因表达的阳性冰冻横切片数≤120片。切片观察可见A组的X-gal染色阳性表达时间约为30天;而B组的X-gal染色阳性表达时间约为60天。脊髓阳性切片计数显示两组β-gal在脊髓表达的高峰期均在9～15天,统计学分析表明两组之间在高峰期间阳性切片数有显著差异(P<0.05)。并且AdLacZ基因在脊髓表达的时间明显延长。2抗病毒中和抗体滴度测定:从用AdLacZ预先皮下致敏的大鼠收集的阳性对照血清证实中和抗体的效价≥1:128,A组转染病毒后第15天血清中可检测到低效价抗病毒中和抗体(1:4),并一直持续至30天。B组在转染后第30天,血清中可检测到低效价抗病毒中和抗体(1:4),并一直持续至60天。与A组相比B组抗体滴度水平低,并且血中产生中和抗体持续在一个很低水平。在统计学上两组有显著差异(P<0.05)。3血标本腺病毒PCR检测:用PCR法从DNA水平分别检测腺病毒在A组、B组的表达情况,腺病毒的DNA量是随时间延长逐渐下降的,A组至30天检测不到腺病毒的表达,B组60天时仍能检测到腺病毒的表达(见附图16,17)结论:在预先致敏的大鼠体内,将AdV介导的CTLA4Ig基因注射入脊髓能有效地抑制局部T淋巴细胞的浸润,从而减轻由AdV介导的局部炎症反应,抑制机体对病毒载体的排斥反应,显著延长LacZ基因在脊髓的表达时间,并且能明显增强与其共同导入的LacZ基因表达强度。而且AdCTLA4Ig对体液免疫应答有明显的抑制作用,能明显延长腺病毒在体内的存留时间。