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阿尔兹海默症（Alzheimer’s Disease,AD）作为痴呆的最重要最常见的发病原因,截至目前其机制仍然不清,也给其治疗带来了巨大的挑战。在AD的治疗方面,国内外研究者面向其不同的病理过程,均进行了大量的尝试,但是仍然缺乏有效的手段遏制病程的进展。随着再生医学的发展,包括干细胞在内的多种具有组织修复及再生能力的细胞逐渐进入我们的视野,并引起了医学界的重视。通过组织工程移植,干细胞移植,调节病变组织周围微环境诱导干细胞更新等手段,可以达到修复病变组织,改善病理过程的目的。而间充质干细胞（Mesenchymal stem cell,MSC）由于其巨大的优势——免疫原性低,成瘤性低,多向分化潜能等,在再生医学领域得到广泛的应用。间充质干细胞移植在神经退行性疾病中也有较多的研究,并取得了令人欣喜的成果。研究表明,MSC-Exo（Mesenchymal stem cell-derived exosome,MSC-Exo）具有比细胞更多的优势:可以透过血脑屏障（Blood brain barrier,BBB）;更易保存和运输;成瘤风险低。本研究首先对我们课题组临床上行MSC移植手术的患者进行疗效分析;进一步在AD疾病模型小鼠上应用MSC-Exo,观察其干预效果,并进一步探究MSC-Exo发挥作用的可能机制。内容一:骨髓间充质干细胞移植治疗中枢神经系统疾病的疗效分析方法:选取2012年～2019年于我院进行MSC移植术的患者为研究对象,术前完善血常规、肝肾功、胸片、头颅CT及MRI等检查,严格掌握适应症,签署知情同意。符合条件的患者进行自体MSC移植:骨穿抽取患者骨髓,细胞分离液提取患者MSC,腰穿鞘内回输分离的自体MSC。分别于术前以及术后6～12月评估患者的临床症状改善情况:脑出血（intracerebral hemorrhage,ICH）、颅脑损伤（traumatic brain injury,TBI）、脑炎（encephalitis）以及缺血缺氧性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）患者,使用国际通用的功能独立性测评（Functional Independence Measure,FIM）以及改良Ashworth痉挛量表评估患者的症状改善情况;使用美国脊髓损伤协会（American Spinal Injury Association,ASIA）神经功能评分表进行脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）患者感觉与运动功能的改变;使用粗大运动功能评价表（Gross Motor Function Measure-88,GMFM-88）对脑瘫（cerebral palsy,CP）患者的病情变化进行评估。利用SPSS 24.0对患者的一般资料以及手术前后各项评分进行统计学分析。结果:随访到的30例患者,全部顺利完成手术,术后均无严重手术并发症和不良反应。30例患者中,症状改善者25例,手术有效率为83.33%。16例TBI患者的FIM评分,运动功能和认知功能评分较之前均有提高,并且差异有统计学意义（P＜0.05）;Ashworth评分上下肢的肌张力在术后分级均降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。ICH患者6例,FIM评分和Ashworth评分在术后均有明显改变。3例CP患者,术后临床症状改善较为明显,GMFM-88评分明显升高,由于病例数量较少未做统计学分析。SCI患者术后临床症状稍有改善。1例脑炎患者手术前后评分显示症状无明显改善。1例HIE患者手术之后症状稍有改善。对所有病例中进行FIM评分和Ashworth评分的患者（TBI,ICH,HIE,脑炎）进行汇总分析显示,手术前后患者的评分差异均有统计学意义（P＜0.001）。结论:经MSC移植术后,多数神经系统疾病患者的病情出现不同程度的缓解,包括运动能力的提高和认知能力的改善,以及感觉功能的恢复。手术创伤小,成功率高,术后并发症低,是一项非常具有前景的治疗方式。值得注意的是,MSC在疾病的治疗中主要是通过旁分泌的方式发挥作用,其中,间充质干细胞来源的外泌体发挥至关重要的作用。因此,我们进一步探究了MSC-Exo对AD小鼠的神经功能障碍的影响。内容二:间充质干细胞外泌体对AD小鼠的疗效研究方法:（1）间充质干细胞原代培养,利用流式细胞术检测间充质干细胞表面标志物的表达;（2）收集MSC培养上清,利用超速离心法进行外泌体的分离纯化,利用Western blot检测外泌体（exosome,EXO）特异性标志物的表达,利用透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）对分离的上清沉淀进行形态观察,利用纳米跟踪技术（nanoparticle tracking analysis,NTA）对分离的EXO进行浓度与粒径的检测;（3）9月大的APP/PS1转基因小鼠尾静脉注射MSC-Exo,取材之后通过免疫化学染色,Western blot法,Golgi-cox染色,硫黄素染色,全细胞膜片钳记录,TEM观察,钙成像以及行为学检测评估模型小鼠的病理改变、神经元形态学改变、电生理变化,线粒体形态和功能异常及行为缺陷;（4）在Aβ刺激的海马神经元中通过钙成像技术评估EXO对钙信号的影响;（5）在SHSY5Y APPswe细胞系和AD小鼠模型中,通过Western blott检测了NF-E2相关因子（NF-E2-associated factor,Nrf2）信号通路的相关分子表达情况。结果:（1）利用贴片法进行原代MSC-Exo的培养,细胞生长状态良好,具有间充质干细胞的典型形态;（2）通过流式细胞术检测提取的MSC的表面标志物发现其高表达基质细胞标记物CD1105、CD44、CD29和CD90,低表达造血干细胞标记物CD45和CD34,提取的干细胞符合国际标准;（3）通过超速离心法提取的MSC-Exo,表达外泌体特异性标志分子CD9、CD63、TSG101,TEM对提取的EXO进行观察,发现其形态为双层膜的杯状双凹圆盘状,符合文献报道,利用NTA技术对提取的EXO进行检测发现其平均直径为110nm左右,97.7%的囊泡直径在114nm左右;（4）MSC-Exo治疗降低了APP/PS1小鼠淀粉样蛋白斑块（Aβ）标志物6E10蛋白的表达,增加了海马神经元突触和树突棘的密度和长度,恢复海马锥体细胞的动作电位,恢复了海马神经元线粒体的损伤,改善了小鼠的认知能力,减少记忆损伤;（5）Nrf2信号通路参与了MSC-Exo在体内和体外的作用。结论:我们通过贴片法培养的MSC生长状态良好,符合国际标准。经超速离心法提取细胞上清所得的蛋白悬液,通过Western blot检测,TEM观察,NTA检测之后发现我们提取的囊泡具有EXO的典型特征。MSC-Exo可改善APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ沉积,增加海马神经元突触的可塑性,改善了小鼠海马神经元的电生理损伤,促进了线粒体的功能恢复,也改善了Aβ诱导的原代神经元的钙信号异常;并且Nrf2信号通路相关的分子在给予MSC-Exo之后发生了明显的表达变化,提示MSCExo在海马神经功能重建过程中,可能涉及到Nrf2信号通路的参与。