肌动蛋白和肌球蛋白存在于烟草悬浮系细胞核及核骨架中的证据

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BY-2型烟草叶片消毒后接种在附加0.5mg/L 2,4-D和0.5g/L酪蛋白的MS培养基中诱导培养,经3-4次继代后,即可得到分散性好、疏松、色泽呈鲜艳黄白色的愈伤组织;将该种愈伤组织接种在附加1mg/L 2,4-D的MS液体培养基中进行振荡培养,经4-5次继代后,即可建立起良好的烟草悬浮系。双酶解法去除烟草悬浮系细胞的细胞壁,获得分散均匀的原生质体。由于技术上的问题,分离得到高纯度的植物悬浮系细胞的细胞核一直是个难点。本研究借鉴动物细胞核的提取方法用含有0.5﹪TritonX-100的CSK缓冲液破坏烟草悬浮系细胞的细胞膜,释放出细胞器。然后参考成株植物细胞核的提取方法采用差速离心和蔗糖-Percoll速率区带离心法最终获得了高纯度的细胞核。向细胞核中加入PI至终浓度为50μg/ml,冰上黑暗染色,上流式细胞仪观察分析,统计正常培养条件下烟草悬浮系细胞所处的细胞周期,结果显示正常培养条件下83.41﹪的细胞处于G<,0>+G<,1>期。接下去,先后用DNase I消化和高盐抽提制备细胞核骨架;同时用试剂盒提取细胞核总蛋白。以兔抗β-肌动蛋白的抗体作一抗,辣根过氧化物酶标记(HRP)的羊抗兔抗体作二抗进行免疫印迹。实验结果证实,烟草悬浮系细胞的细胞质、细胞核及核骨架中均存在与β-肌动蛋白抗体呈阳性反应的抗原。以兔抗细胞核肌球蛋白I β的抗体作一抗,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体作二抗进行免疫印迹。实验结果显示,烟草悬浮系细胞的细胞核中存在与细胞核肌球蛋白I β抗体呈阳性反应的抗原而核骨架中则没有。上述实验结果证实,β-肌动蛋白是烟草悬浮系细胞核及核骨架的组成成分,同时细胞核肌球蛋白I β也是其细胞核的组成成分。本实验首次找到了发现于小鼠纤维原细胞细胞核并普遍存在于动物细胞核中的肌球蛋白I β同样也存在于烟草悬浮系细胞核中的证据,填补了一项科研空白。作者推测了肌动蛋白和肌球蛋白在植物细胞核及核骨架中存在的意义和可能发挥的作用,同时认为细胞核中的肌动蛋白和肌球蛋白在生物进化过程中可能是相当保守的。
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