酶法合成头孢氨苄过程中固定化青霉素酰化酶酶活稳定性及其再生研究

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头孢氨苄(Cephalexin)是第一代可用于口服的头孢类抗生素,具有抗菌谱广、杀菌力强、耐酸、胃肠吸收好等优点,该药被列入我国和其他各国基本药物目录中。与传统的化学法相比,酶法合成头孢氨苄具有反应条件温和,工艺操作简单,无需基团保护,清洁安全等优点。目前国内外均使用固定化青霉素G酰化酶(Penicillin G acylase,PGA)合成头孢氨苄。固定化PGA价格昂贵,如何最大程度地使固定化PGA酶活保持稳定,从而最大程度地提高固定化PGA的重复使用次数,是当前酶法合成头孢氨苄生产中亟待解决的问题之一。本课题对酶法合成头孢氨苄时造成青霉素酰化酶酶活降低的因素,如何改善固定化青霉素酰化酶稳定性,以及失活固定化PGA的再生进行了研究。造成青霉素酰化酶酶活降低的因素研究。7-ADCA和PGM对固定化PGA有很强的抑制作用,而且PGM的抑制作用几乎与其浓度无关;头孢氨苄对固定化PGA具有产物抑制作用,而且这种抑制作用与其浓度呈正相关;固定化PGA在反应温度≤30℃,酶反应液pH值为6.5时,固定化PGA酶活稳定性最好;磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液可显著提高固定化PGA酶活稳定性。改善固定化青霉素酰化酶稳定性的研究。研究了金属离子、表面活性剂、糖类、氨基酸以及醇类对固定化PGA酶活的影响。Ca2+对固定化PGA的有激活作用,使其酶活提高了10.65%。添加果糖、聚乙烯醇和异丙醇可显著提高固定化PGA酶活。赖氨酸和甘氨酸对固定化PGA有很大的激活作用,使其酶活增加了34%以上;而色氨酸和叶酸有明显的抑制作用。异丙醇、L-赖氨酸、Ca2+、聚乙烯醇复合加入到头孢氨苄反应液时,它们之间没有协同作用。酶法合成头孢氨苄时添加0.5%异丙醇,使得固定化PGA重复使用次数达16次,比未添加的对照相比提高45.45%,固定化PGA的酶活稳定性获得了非常显著的改善。失活固定化PGA进行了再生研究。去离子水洗涤和酸水(pH6)洗涤对失活固定化PGA没有再生作用,而碱水(pH8)洗涤具有再生作用。30℃下用pH8碱水洗涤60 min,使其酶活提高5.7%。超声处理(频率28 KHz,15 min)使得失活固定化PGA酶活提高了5.67%。展开-再折叠再生法对失活固定化PGA的再生无效。介质直接再生法(30%乙二醇+100 mM7-ADCA)对失活固定化PGA具有再生效果,使其酶活提高13.81%。失活固定化PGA的适宜再生方法为:首先用30%乙二醇-100mM7-ADCA溶液浸泡60 min,然后用碱水洗涤60 min,最后用28 KHz超声处理15min,使失活固定化PGA酶活力恢复率达77.75%,再生效果良好。
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