目的： 本实验利用基因工程技术，寻找制备结核分枝杆菌(MycobacteriumTuberculosis，MTB)6kDa早期分泌性抗原靶(Early secreted antigenic target-6kDa，ESAT6)、培养滤液蛋白10(Culture tilt rate protein 10，CFP10)、CFP10-ESAT6重组蛋白的方法和条件，并研究其免疫活性，为研究此三种蛋白作为临床诊断试剂或预防治疗药物打下基础。 方法： 1.原核表达载体载体的构建：设计pET32a(+)-ESAT6、pET32a(+)-CFP10、pET32a(+)-CFP10-ESAT6载体构建策略，并运用DNAStar生物软件预测分析载体基因及重组蛋白的抗原位点。 分别设计ESAT6、CFP10引物，从MTB标准株H37Rv基因组中扩增ESAT6、CFP10片段，在ESAT6、CFP10片段间加入linke合成CFP10-ESAT6融合基因；分别定向克隆入pET32a(+)原核表达载体多克隆位点中，再经PCR、酶切等方法鉴定并测序，筛选阳性重组子。 2.重组ESAT6、CFP10、CFP10-ESAT6蛋白(rESAT6、rCFP10、rCFP10-ESAT6)的表达与纯化分别在不同浓度IPTG、不同时间、不同温度条件下对重组菌进行诱导，并进行SDS-PAGE电泳分析，优化诱导条件，Western-blotting检测、镍柱纯化目的蛋白。 3.表达蛋白的免疫活性与初步应用 ①将上述3个重组蛋白分别加弗氏佐剂每隔14d免疫小鼠三次。 ②将rESAT6蛋白和PPD分别体外刺激rESAT6蛋白免疫小鼠的脾淋巴细胞，MTT法检测淋巴细胞增殖水平。 ③rESAT6蛋白作为包被抗原与单抗HYB076-08作方阵滴定，rCFP10、rCFP10-ESAT6两蛋白的包被量参考rESAT6浓度，三种蛋白都与阴性血清做方阵滴定，确定抗原抗体的最佳工作浓度，间接ELISA法检测免疫小鼠血清抗体，评估表达蛋白的免疫活性。 ④在检测免疫小鼠血清的ELISA法基础上，用rESAT6蛋白作为包被抗原与单抗HYB076-08作方阵滴定，PPD组与阳性结核猴血清作方阵滴定，确定抗原抗体的最佳工作浓度，以PPD为平行参照组，以rESAT6蛋白对结核病猴(PPD皮试阳性、X光透视阳性)、健康猴(PPD皮试阴性、X光透视阴性)分别进行检测，以确定rESAT6蛋白ELISA法检测猴结核的有效性。 ⑤用上述rESAT6蛋白为抗原ELISA检测猴血清抗体的方法，以PPD ELISA方法检测方法为对照，检测10只待检猴血清(同时设立阴性、阳性、空白对照)，检测结果与PPD ELISA、PPD皮试对比分析，初步应用于猴结核的检测。 结果 1.DNAstar预测分析结果表明外源基因大小正确，读码框无移位，重组蛋白的抗原位点未被掩蔽。经酶切、PCR、测序鉴定，表明pET32a((+)-ESAT6、pET32a(+)-CFP10、pET32a(+)-CFP10-ESAT6三个原核表达载体构建成功。 2.重组目的蛋白的最佳诱导条件为IPTG浓度为1mM，25℃诱导6h，成功获得rESAT6、rCFP10及rCFP10-ESAT6融合蛋白，可溶性目的蛋白表达量分别占全菌可溶性总蛋白的35.5％、38.1％、18.7％，分离纯化后每g工程菌可获得的可溶性目的蛋白量达2.247mg-6.536mg。 3.Western-blotting结果显示rESAT6蛋白与ESAT6单抗HYB076-08相互反应，在2.5×104左右有一条特异的印记带。 4.ESAT6蛋白及PPD刺激免疫后小鼠脾淋巴细胞，rESAT6组脾淋巴细胞增殖刺激指数SI为2.232±0.10，PPD平行组SI为2.283±0.12。 5.三种重组蛋白均能刺激小鼠产生相应抗体。其中rCFP10-ESAT6蛋白抗体OD值明显高于rESAT6和rCFP10组(P<0.05)。 6.初步建立并验证了用rESAT6蛋白作为包被抗原与单抗HYB076-08作方阵滴定ELISA检测猴血清相应抗体方法。用方阵法确定了抗原包被量为100ng/孔，一抗猴血清稀释度为1:40，标记二抗稀释度为1:5000，以rESAT6蛋白为包被抗原ELISA法检测结核病猴和健康猴血清检测结果分别为阳性和阴性。 7.以rESAT6初步作为抗原检测待测猴血清相应抗体，结果10个样品中9个与PPD ELISA检测、PPD皮试结果一致，符合率为9/10。 结论： 1.成功构建pET32a(+)-ESAT6、pET32a(+)-CFP10、pET32a(+)-CFP10-ESAT6原核表达载体，建立较好表达条件，并大量获得纯化蛋白。 2.以表达蛋白为抗原刺激正常小鼠，MTT法检测到免疫后小鼠脾淋巴细胞增殖，ELISA法检测免疫小鼠蛋白抗体，表明rESAT6、rCFP10和rCFP10-ESAT6蛋白在细胞免疫和体液免疫方面均有免疫活性。 3.初步建立并应用rESAT6蛋白作为抗原ELISA检测待测猴血清抗体方法，该方法有望应用于猴结核病检测。