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慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B，CHB)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis BVirus，HBV)引起的。它是一种需要通过反转录方式进行复制的大小约3.2 Kb部分双链的DNA病毒。在其生活周期中，部分双链DNA必须形成完整的双链并经过拓扑学方面修饰成为共价闭合环状DNA(covalently closed circle DNA，cccDNA)，并以此为模板进行转录、翻译和复制，完成其整个生命周期。复制过程中合成的部分双链DNA重新入核形成新的cccDNA以维持其在宿主平均每个肝脏细胞1-50个拷贝的含量，低拷贝含量限制了与其相关的研究进展。此外，HBV感染具有严格宿主种属特异性，而HBV转基因小鼠无法形成cccDNA。因此，目前缺乏成熟的适合研究HBV cccDNA的体内模型工具。之前通过Cre/loxP重组系统将与野生型cccDNA大小、特性等均相似的重组cccDNA(recombinantcccDNA，rcccDNA)通过尾静脉高压注射的方式导入免疫健全野生小鼠体内成功构建了rcccDNA高含量且易于检测的HBV持续感染小鼠模型，病毒抗原可持续表达至9周，而不能形成cccDNA的HBV复制质粒只维持2周的感染。这点提示cccDNA与HBV持续性感染存在重要关系。本课题中，通过3种新的模型层层递进地证明了cccDNA是HBV慢性化以及导致慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌的重要因素。首先，利用位点专一性重组(attB/attP，phi31)技术体外直接合成为微环形式的含有内含子及attR短臂的重组cccDNA（rcccDNAattR）并通过尾静脉高压注射方式导入野生型小鼠体内，研究发现了与非微环形式的HBV复制质粒pwtHBV1.3相比，此组小鼠呈现出HBV持续性感染。由于体内清除HBV的因素主要来自于CD8+T细胞非杀伤性作用，因此便利用短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)技术在质粒p州HBV1.3及cccDNA前体质粒(prcccDNA)的HBs阅读框（open reading frame，ORF）中插入了针对参与形成MHC-Iβ链的β2-微球蛋白(B2M)的shRNA（pwtHBV1.3-shB2M，prcccDNA-shB2M），以此来弱化机体CD8+T细胞对HBV的免疫反应。通过高压尾静脉注射方式，在有Cre重组酶存在的情况下，prcccDNA-shB2M形成两部分:rcccDNAloxP和B2M-shRNA。研究发现含有pwtHBV1.3-shB2M组的小鼠仍然在两周内清除，与pwtHBV1.3无区别，而能形成rcccDNA的则持续性感染达20周以上。至此证明了cccDNA也许是HBV慢性化的主要原因，但是尾静脉高压注射方式只能感染4-10％的肝细胞，为了解决这一个问题，最终将前体rcccDNA部分(prcccDNA)构建到具有广谱高感染性的腺病毒载体上(Ad-rcccDNA)，这个模型仍是通过Cre/loxP系统实现重组的。当病毒进入肝脏特异性表达Cre重组酶的Alb-Cre转基因小鼠体内，Ad-rcccDNA经过重组形成Ad-loxP和rcccDNAloxP两部分。结果表明在高滴度感染的条件下，Ad-loxP部分很快被机体控制而长期存在的rcccDNAloxP却导致了HBV持续性感染及反复的慢性肝炎(血清转氨酶(serum alanine aminotransferase，sALT)在50～300U/ml之间摆动），并在约10周左右呈现出肝纤维化，随着感染时间的延长，肝纤维化程度加深。感染20周左右，肝脏出现肉眼可见病灶。至此，首次构建了基于rcccDNA的，能够反映部分甚至整个HBV持续性感染到肝脏疾病发生发展乙型肝炎疾病小鼠模型。综上所述，本文成功构建了基于HBV重组cccDNA的HBV相关肝脏疾病小鼠模型，并在实验室水平证实cccDNA在HBV慢性化以疾病发生发展中具有重要的作用。