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目的:头颈部肿瘤是常见威胁人类健康的恶性肿瘤,而喉癌是最主要的头颈部恶性肿瘤之一,并且喉癌的发病率仍在逐年增加。尽管对喉癌的治疗方法不断改善,其五年生存率未明显提高。因此,寻找治疗喉癌的新疗法迫在眉睫。耗竭肿瘤生长所必需的氨基酸,达到“饿死”肿瘤细胞效果的氨基酸耗竭酶成为抗肿瘤研究的热点。对于大多数肿瘤细胞自身不能合成天冬酰胺,必须依赖外源的天冬酰胺才能生存。天冬酰胺酶(asparaginase)可通过降解天冬酰胺,从而抑制肿瘤细胞中蛋白质的合成,导致肿瘤细胞的死亡。目前天冬酰胺酶临床已被用于白血病、淋巴瘤和黑色素瘤的治疗。然而,针对于喉癌的治疗却尚未报道。细胞自噬是通过依赖于溶酶体降解蛋白质和细胞器,对降解产物循环利用的过程。正常情况下,自噬保持低水平状态。在内外界压力下自噬可快速上调,以维持细胞稳态。近年来的研究表明,自噬在肿瘤治疗方面起“双刃剑”作用,治疗肿瘤时细胞自噬既能提高肿瘤细胞的生存能力,也能加速细胞死亡。对于天冬酰胺酶耗竭天冬酰胺是否在喉癌细胞中诱导自噬,及自噬在其起的作用未有报道。方法:1、MTT法检测天冬酰胺酶对喉癌细胞Tu212和Tu686的细胞毒性,以及联合自噬抑制剂氯喹(CQ)对细胞的毒性影响;检测抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)在天冬酰胺酶对喉癌细胞生长作用的影响;2、流式细胞术检测细胞凋亡。天冬酰胺酶单独、联合自噬抑制剂CQ对Tu212和Tu686细胞凋亡的影响;抗氧化剂NAC对天冬酰胺酶诱导喉癌细胞凋亡的影响;3、透射电子显微镜(TEM)观察天冬酰胺酶诱导Tu212和Tu686细胞中自噬体的产生;4、Western blot法检测在Tu212和Tu686细胞中天冬酰胺合成酶(ASNS)的表达情况;检测天冬酰胺酶单独作用、联合CQ作用时,喉癌细胞中自噬特异蛋白LC3-II的表达情况;检测凋亡相关蛋白Caspase 3、PARP表达量的变化;5、激光共聚焦显微镜(Confocal microscopy)检测自噬及自噬流的产生情况。结果:喉癌细胞Tu212和Tu686中天冬酰胺合成酶表达缺失;天冬酰胺酶通过耗竭天冬酰胺对喉癌细胞Tu212和Tu686细胞显著杀伤。天冬酰胺酶能诱导喉癌细胞产生显著细胞凋亡,并且诱导凋亡相关蛋白Caspase 3、PARP剪切,Caspase抑制剂z-VAD-fmk明显减弱天冬酰胺酶诱导的Tu212和Tu686细胞凋亡,因此表明天冬酰胺酶诱导细胞凋亡是依赖Caspase途径。天冬酰胺酶能诱导喉癌细胞中自噬体的出现,诱导LC-II表达,以及自噬流的产生。天冬酰胺酶引起的自噬伴随信号通路Akt/mTOR的抑制和信号通路Erk1/2的激活,表明Akt/mTOR信号通路和Erk1/2信号通路参与了天冬酰胺酶诱导喉癌细胞自噬中的分子调控机制。值得注意的是,联合自噬抑制剂CQ作用于喉癌细胞时,显著增强天冬酰胺酶对喉癌细胞Tu212和Tu686的生长抑制以及细胞凋亡。这表明,当天冬酰胺酶作用于喉癌细胞时,细胞自噬在此过程中起保护性作用。抗氧剂NAC可以明显抑制天冬酰胺诱导的细胞自噬,并且天冬酰胺引起的细胞毒性也显著性减弱,表明ROS在天冬酰胺酶诱导的自噬及细胞毒性中发挥重要作用。综上所述:天冬酰胺酶对喉癌细胞Tu212和Tu686有显著的细胞毒性。天冬酰胺酶能诱导喉癌细胞发生自噬。抑制细胞自噬明显增强天冬酰胺酶对喉癌细胞杀伤作用。因此,为喉癌治疗提供新的思路。