论文部分内容阅读
赖氨酸变位酶（Lysine2,3-aminomutase，EC5.4.3.2.）能催化L-赖氨酸和L-β-赖氨酸之间的转换。已报道的枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）中与赖氨酸代谢相关的赖氨酸变位酶（KAM）基因簇受E因子控制。生物信息学分析发现kam基因簇在蜡样芽胞杆菌族（Bacillus cereusgroup）中结构较保守，且都含有依赖于54的转录调节因子，说明kam基因簇在蜡样芽胞杆菌族中的表达调控方式与其他细菌中不同。54因子不同于70家族，能够特异性识别启动子-12/-24区，参与了许多代谢途径的调控，目前对蜡样芽胞杆菌族54因子调控代谢途径的报道较少。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）属于蜡样芽胞杆菌族，是世界上应用最为广泛、用量最大、效果最好的微生物杀虫剂。本实验室在苏云金芽胞杆菌HD73菌株中发现了8个依赖于54的转录调节因子，可能参与不同的代谢途径，其中包括赖氨酸变位酶所在的赖氨酸降解途径。对于该途径的研究有望从代谢调控角度分析芽胞、晶体形成机制，为有效利用碳源、氮源，提高苏云金芽胞杆菌芽胞及晶体产量提供借鉴。对kam基因簇的结构进行了分析。生物信息学分析表明Bt HD73菌株kam基因簇有9个基因：yodT（HD732534）编码转氨酶、yodS（HD732535）和yodR（HD732536）编码3-羰基-6-乙酰氨己酸裂解酶复合体、yodQ（HD732537）编码脱乙酰酶、yodP（HD732538）编码β-赖氨酸乙酰转移酶、kamR（HD732539）编码依赖于54的转录调节因子、kamA（HD732540）编码赖氨酸变位酶、yokU/yozE（HD732541/HD732542）编码未知功能蛋白。KamR蛋白含有与54互作的AAA结构域，与DNA结合的HTH结构和接受信号的PAS结构域，是典型的依赖于54的转录调节因子的结构特点。确定了Bt HD73kam基因簇的转录情况和kamA基因的转录起始位点。有两个同向转录单元——yodT-yodS-yodR-yodQ-yodP-kamR与kamA-yokU-yozE。通过5′RACE分析确定了kamA基因的转录起始位点：在sigK突变体中kamA的转录起始位点在起始密码子ATG上游27bp处；而在sigL突变体中kamA的转录起始位点位于起始密码子ATG上游143bp处。对kam基因簇的转录调控机制进行了分析。利用同源重组的方法获得了kamR基因缺失的kamR突变体和kamA-yokU-yozE基因缺失的kamA突变体。分别构建了两个转录单元的启动子PyodT和PkamA与lacZ基因的融合载体，并将上述载体转入HD73菌株、kamR突变体、sigE突变体、sigL突变体、sigH突变体以及sigK突变体等。通过测定β-半乳糖苷酶活性发现yodT的转录受H控制；kamA的转录受L、 H和K因子共同控制，并受KamR和GerE的调控。凝胶阻滞结果证明SigK和GerE能直接结合在kamA基因的启动子区域。对突变体的相关表型进行了测定。利用生长曲线测定法、总蛋白定量法以及测定芽胞形成率的方法分析kamR突变体和kamA突变体的表型，结果表明kamR突变体与kamA突变体的生长情况及晶体蛋白产量没有变化，但是kamR突变体的芽胞形成率有所下降，说明KamR可能通过调控其他受Sigma54控制的基因影响了芽胞形成率。