湛江地区水产养殖场大肠杆菌耐药和毒力特点及分子分型研究

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为了解氟苯尼考对水生细菌耐药性的影响以及湛江地区水产养殖场大肠杆菌耐药和毒力特点以及分子分型情况,进行了氟苯尼考胁迫模型下水体细菌对抗菌药物的敏感性试验,湛江地区水产养殖场大肠杆菌耐药性和耐药基因检测及大肠杆菌分离株毒力基因及分子分型分析。主要研究结果如下:(1)氟苯尼考对水生细菌耐药性影响的研究建立氟苯尼考胁迫模型,采用微量肉汤二倍稀释法和药敏纸片试验法对第0d、14 d、28 d、56 d分离的水生细菌进行药物敏感性试验。结果表明,第56 d收集的Ⅴ组(100 mg/L)水生细菌对氟苯尼考耐药率最高,为25%;分离的氟苯尼考敏感菌和耐药菌对17种抗菌药中的阿莫西林、链霉素和多西环素等8种药物的敏感性差异极显著(P<0.01)。(2)湛江地区水产养殖场大肠杆菌耐药性及耐药基因检测从湛江地区三个水产养殖场水体、土壤和底泥样品中分离鉴定出90株大肠杆菌,利用药敏纸片试验法检测分离株对23种抗生素的耐药性,利用PCR法检测分离株对29种耐药基因的携带情况。结果表明,90株大肠杆菌对青霉素、阿莫西林、氨苄西林等9种药物耐药率较高(≥70%);对氨曲南、庆大霉素、阿米卡星等11种药物耐药率都较低(≤30%)。同一菌株至少耐2种药,最多耐16种药,同时耐9种药物的菌株数最多(19株)。耐药基因检测发现90株分离株对bla TEM、bla CIT、flo R等9种耐药基因检出率较高(≥50%);对bla KPC、bla IMP、cfr等13种耐药基因检出率较低(≤30%)。同一菌株至少检出4种,最多检出15种耐药基因,其中携带10种耐药基因的菌株数最多(14株)。总体来看,养殖场Ⅱ耐药情况最复杂。相关性分析发现bla TEM、bla CIT、flo R、Optr A、cml A、aac(3)-Ⅱ、Sul2、ere A、erm B、oqx B、qnr A、mcr1、mcr2耐药基因与耐药性符合率较高(≥50%)。(3)大肠杆菌分离株毒力基因及分子流行特征研究选取30株湛江地区水产养殖场分离的大肠杆菌,利用三重PCR法进行系统发育群鉴定,对大肠杆菌进行全基因组测序后分析统计其毒力基因、血清型以及多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST),并利用PHYLOVIZ-2.0和MEGA 7.0软件对ST型结果进行聚类分析和系统进化树构建。30株大肠杆菌主要携带fim C(70%)、tsh(66.67%)、omp T(53.33%)毒力基因,养殖场Ⅱ携带毒力基因种类最丰富(20种),菌株携带的耐药基因和毒力基因之间未发现存在相关性。30株大肠杆菌的定型率为80%(24/30),O81为优势血清型。大多数分离株属于B2群(26.67%)和D群(46.67%),耐药基因与系统发育群相关性分析发现B2群和D群大肠杆菌携带的耐药基因类型较A群和B1群丰富。30株大肠杆菌有23种ST型,ST3856为流行ST型。Ⅰ-26和Ⅲ-21菌株同属ST2179,血清型同为O9,均携带11种毒力基因,毒性最强,系统发育群同为D群。聚类分析和系统进化树显示不同水产养殖场分离株之间具有一定亲缘关系。研究表明,氟苯尼考在一定程度上增加了水生细菌耐药性;湛江地区大肠杆菌耐药性严重,携带的耐药基因复杂;湛江地区水产养殖场大肠杆菌具有丰富的多样性,潜存致病性,菌株之间存在一定的进化关系。
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