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目的:在法医学实践中,经常可见持续而严重的应激事件导致当事人出现精神症状甚至死亡的案件。由于缺乏对应激性损伤的诊断标准或诊断体系,给法医学鉴定带来很大的困难。杏仁核作为情感中枢,在情绪调节方面发挥重要作用。前期研究发现:内质网应激广泛参与杏仁核基底外侧核神经细胞的损伤过程,而内质网应激的未折叠蛋白或错误折叠蛋白会激活自噬。自噬是真核细胞中普遍存在的一种生命现象,自噬的激活发挥双刃剑的作用,适度的自噬有助于细胞的生长发育;过度自噬则会导致细胞损伤。ClassⅢPI3K-Beclin1复合体途径是自噬早期形成自噬前体的关键通路,该通路可以启动自噬并正向调节自噬。3-甲基腺嘌呤(3-MA)是ClassⅢPI3K的特异性抑制剂。然而,自噬在应激性神经细胞损伤中发挥怎样的作用目前尚不清楚。因此,本研究拟建立束缚应激大鼠模型,从整体动物水平,观察ClassⅢPI3K-Beclin1信号通路在杏仁核基底外侧核区神经细胞中的表达;通过使用ClassⅢPI3K-Beclin1信号通路特异性抑制剂3-MA,对比观察以阐明ClassⅢPI3K-Beclin1信号通路在应激导致杏仁核基底外侧核神经细胞损伤中的作用机制。为应激导致精神损伤或者死亡的法医学鉴定提供科学理论支持。方法:建立大鼠束缚应激模型。实验分组为Control组(21天)、1天组、3天组、7天组、14天组和21天组。然后检测大鼠杏仁核自噬相关蛋白的表达状态,选取自噬最强的时间点(7天)作为自噬抑制剂(3-MA)使用的时间点。Control组(7天)、自噬抑制剂组(3-MA组)、束缚应激7天组(Stress组)、束缚应激7天+自噬抑制剂组(Stress+3-MA组)。通过体重变化、高架十字迷宫实验和旷场实验观察大鼠焦虑行为变化及评价模型是否建立成功。应用HE染色和甲苯胺蓝染色观察大鼠杏仁核BLA区神经细胞的病理学改变。免疫组织化学染色、免疫荧光染色和Western blot技术检测杏仁核BLA区神经细胞内自噬相关蛋白ClassⅢPI3K、Beclin1、LC3(LC3-Ⅱ/Ⅰ)、P62的表达变化。结果处理与统计分析:采用SPSS23.0进行统计学分析,所有数据以均数±标准差(Means±SD)表示。各组均数的比较,当方差齐时,采用独立t检验进行两组间的比较,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多组间比较,并采用Tukey post hoc test进行两两比较;当方差不齐时,采用非参数检验Kruskal–Wallis检验,并采用Dunn’s multiple comparison test进行两两比较。所有统计学结果均以P<0.05为有统计学差异。结果:1.与对照组相比,束缚应激大鼠体重增长缓慢。2.高架十字迷宫及旷场实验观察到:(1)应激大鼠与对照组相比出现明显的焦虑样行为,且随应激时间的延长,症状逐渐加重。(2)Stress7天+3-MA组与Stress7天组大鼠相比焦虑样行为程度明显减轻;但与对照7天组和3-MA组相比仍有焦虑样行为改变。3.HE染色结果表明:(1)随着应激时间的延长,杏仁核BLA区神经细胞逐渐出现水肿,组织结构疏松,神经细胞固缩,小胶质细胞增生,并出现卫星现象和嗜神经现象。(2)Stress7天+3-MA组杏仁核BLA区神经细胞固缩数量及小胶质细胞增生程度与Stress7天组相比均明显减轻。4.甲苯胺蓝染色结果表明:(1)随着应激时间的延长,杏仁核BLA神经细胞逐渐出现水肿,组织结构不清,尼氏体排列不规则、消失,细胞固缩深染等现象,并可见卫星现象。(2)Stress 7天+3-MA组杏仁核BLA区神经细胞变性现象较Stress 7天组相比有所减轻。表明自噬抑制剂3-MA可以改善杏仁核BLA区神经细胞的损伤。5.免疫组织化学染色、免疫荧光染色和Western blot检测结果显示:(1)与对照组相比,束缚应激组大鼠杏仁核BLA区神经细胞中PI3K、Beclin-1、LC-3(LC3-Ⅱ/Ⅰ)蛋白表达随着应激时间的延长呈现先升高后下降的趋势,应激1天组、3天组和7天组逐渐升高,且于应激7天达高峰;14天组、21天组阳性表达逐渐减少,但仍高于对照组;P62蛋白表达随着应激时间的延长,呈现先降低后升高的趋势,应激1天组、3天组和7天组逐渐降低,且于应激7天达最低值;14天组、21天组阳性表达逐渐升高,但仍低于对照7天组。(2)与Stress 7天组相比,Stress 7天+3-MA组PI3K、Beclin-1、LC-3(LC3-Ⅱ/Ⅰ)蛋白阳性表达明显下降,但仍高于对照7天组和3-MA组;P62蛋白表达明显增高,但仍低于对照7天组和3-MA组。提示束缚应激诱导了自噬ClassⅢPI3K-Beclin1通路的激活,并引起下游LC3(Ⅱ)的增加和P62的减少。而给予ClassⅢPI3K-Beclin1通路抑制剂3-MA后,ClassⅢPI3K-Beclin1通路相关蛋白的表达水平均降低,抑制了ClassⅢPI3K-Beclin1通路的激活。结论:1、束缚应激能够诱导大鼠杏仁核BLA区神经细胞的损伤。2、ClassⅢPI3K-Beclin1信号通路介导的自噬参与了慢性束缚应激导致的杏仁核基底外侧核神经细胞的损伤。