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基因芯片技术是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项新技术。它具有高通量、微型化、自动化的特点,可以同时检测同一组织或不同组织中成千上万个基因的表达水平,识别差异表达基因,在研究疾病相关基因方面具有极大的优越性。cDNA芯片是基因芯片的一种,它在mRNA水平研究基因表达的情况,具有应用技术相对成熟、成本相对低等优点。
子宫内膜癌是妇科三大恶性肿瘤之一,近年来发病率有上升的趋势,子宫内膜样腺癌是其中最常见的一种病理类型,研究表明子宫内膜样腺癌是雌激素诱发的一种多基因疾病。目前对子宫内膜癌相关基因的研究多采用RT-PCR、免疫组化等方法,一次只能检测一个或几个基因的表达变化,不能全面反映各基因间的关系。尽管目前已有应用基因芯片技术筛查子宫内膜癌相关基因的报道,但一般病例数很少,致使所得出结论的代表性不强;多数研究应用的是市售芯片,相对于肿瘤来讲针对性不强。因此,我们有必要应用肿瘤相关基因cDNA芯片研究子宫内膜癌的基因表达谱。
本研究通过查找基因克隆信息,选择了目前已知的肿瘤相关人类基因克隆,设计制备了肿瘤相关基因cDNA芯片,应用这种芯片对子宫内膜癌标本进行检测,探讨子宫内膜癌发生发展的分子机制,期望为疾病的早期诊断、靶向治疗和预后监测等提供试验依据。
目的:
应用肿瘤相关基因cDNA芯片筛查子宫内膜癌相关基因,探讨子宫内膜癌发生和发展的分子机制,为临床治疗和预后监测提供参考。
方法:
1.在山东省医药生物技术中心芯片室原有肿瘤相关基因的基础上查阅资料选择并购买基因克隆,摇菌,提取质粒,PCR扩增,获得肿瘤相关基因PCR产物,经纯化后点至玻片上,制备成包含5952个基因点的肿瘤相关cDNA芯片。
2.标本60份,正常子宫内膜组织30例(增殖期子宫内膜),子宫内膜癌组织30例(子宫内膜样腺癌)。提取组织总RNA(将30例正常子宫内膜的总RNA等质量混合),反转录后标记为cDNA探针,与芯片杂交后经扫描获取图象,应用Quantarray3.0软件分析,得到基因表达的数据资料。应用半定量RT-PCR方法对cDNA芯片检测到的某些差异表达基因进行验证。
结果:
1.自制的包含5952个基因点阵的cDNA芯片,实验证实标本与芯片杂交结果良好,扫描图象信号清晰,背景噪声低,重复性好。
2.30例子宫内膜癌,发生半数以上差异表达的基因154个,上调基因94个,下调基因60个。将基因按照功能分为:(1)癌基因和抑癌基因;(2)细胞增殖、凋亡相关基因;(3)生长因子及其受体类;(4)细胞周期调控相关基因;(5)细胞外基质降解相关蛋白酶类及其抑制剂;(6)黏附分子类;(7)热休克蛋白;(8)代谢相关酶类基因。
3.用半定量RT-PCR验证了E-cadherin基因的表达特征与芯片检测结果一致。
结论:
1.本研究制备的肿瘤相关基因cDNA芯片,可以快速、系统、准确地揭示基因的表达特征,具有针对性强,实用性好,成本低等特点,具有一定的推广应用价值。
2.通过比较正常子宫内膜与子宫内膜癌之间的基因表达差异,可以发现子宫内膜癌发生发展的分子机制,为下一步建立基因预后图谱提供了重要参考。