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目的意义:着眼于山西省大宗道地药材-浑源黄芪微生物资源及其应用潜力挖掘,本研究以浑源黄芪特有的浓重“豆腥味”属绿叶挥发物为线索,以多年生浑源黄芪为实验材料,表征其内生菌群组成及功能。结果表明,绿叶挥发物是影响浑源黄芪内生菌招募、促生菌功能的重要因素,绿叶挥发物及其微生物转化产物均具有诱导黄芪活性成分合成积累的作用。因此,研究结果对于基于生态适应的经济作物及中药材微生物资源挖掘与利用,对于发展可持续发展的中药材种植业、中药资源持续利用具有一定的启迪和示范作用。研究内容与方法:(1)浑源黄芪内生细菌菌群组成及其功能:以传统采收期黄芪药材为实验材料,稀释平板法进行菌株分离,16S r RNA测序法进行菌株鉴定;通过添加色氨酸、钾长石、绿叶挥发物等外源物质的方法进行促生菌筛选,顶空GC-MS法测定黄芪绿叶挥发物含量;(2)E-2-己烯醛促进菌株H65生长作用机制:采用冰水浴预处理接种剂、E-2-己烯醛处理的方法首先表征绿叶挥发物促进H65生长的特性,采用高通量测序方法找出与E-2-己烯醛处理有关的基因并进行代谢途径富集及转化产物预测,最后采用q RT-PCR、GC-MS法进行验证;(3)E-2-己烯醛和2,3-丁二醇促进黄芪异黄酮、三萜皂苷合成积累作用:以黄芪根培养物为材料,添加等浓度E-2-己烯醛和2,3-丁二醇至培养液,以芒柄花黄素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮葡萄糖苷为代表性异黄酮成分,黄芪皂苷Ⅳ为代表性三萜皂苷,UHPLC-MS法测定含量。研究结果:(1)浑源黄芪内生细菌菌群组成及其功能:共分离得85株代表性内生细菌菌株,分属于泛菌属等13个属,其中假单胞菌属(Pseudomonas)、泛菌属(Pantoea)和葡萄球菌属(Staphylococcus)菌株数量较高,占分离菌株总数的80.00%;筛选获得的促生菌中,具有吲哚乙酸合成能力的菌株占比最高(69.41%),其次为含ACC脱氨酶和具有固氮活性的菌株(占比分别为40.00%和31.76%),解磷、解钾菌株所占比例较低(14.12%、7.06%);具双重促生活性的菌株中,兼具吲哚乙酸合成与含ACC脱氨酶菌株所占比例最高(37.65%),其次为兼具吲哚乙酸合成和固氮活性、兼具含ACC脱氨酶和固氮活性的菌株,分别占分离菌株的28.24%和24.71%,兼具含ACC脱氨酶和解钾活性的菌株占比最低(1.18%);2-50μmol/L正己醛和Z-3-己烯醛、5-125μmol/L正己醇具有促进部分含ACC脱氨酶内生菌株生长的作用;(2)E-2-己烯醛促进菌株H65生长作用机制:冷预处理接种剂12 h,E-2-己烯醛促进菌株生长效应最佳,促进效应与菌株中环境信息加工、己糖代谢、有害物质降解等相关基因表达上调有关。根据差异表达基因注释,nem A和DAR所编码酶应参与E-2-己烯醛还原和2,3-丁二醇合成过程,二者表达丰度及培养液中2,3-丁二醇的定量分析表明,E-2-己烯醛应在细胞生长早期运输至胞内,在葡萄糖等C源不足时的对数生长后期的菌体细胞中还原、进而转化为2,3-丁二醇;(3)E-2-己烯醛和2,3-丁二醇促进黄芪异黄酮、三萜皂苷合成积累作用:二者均具有诱导黄芪毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪皂苷Ⅳ等多种活性成分合成积累的作用。比较而言,E-2-己烯醛促进毛蕊异黄酮葡萄糖苷合成积累作用较2,3-丁二醇强,持续时间更长;黄芪皂苷Ⅳ合成途径对2,3-丁二醇响应更为快速,但持续促进作用不及E-2-己烯醛。结论:浑源黄芪中存在绿叶挥发物促生菌株,该类菌株可以利用绿叶挥发物,作为备选营养源,通过还原酶作用、用于合成2,3-丁二醇;绿叶挥发物及其微生物转化产物均具有诱导黄芪异黄酮类、三萜皂苷类活性物质合成积累的作用,但诱导作用特征不同,就黄芪皂苷Ⅳ而言,微生物转化产物诱导作用更为快速,而绿叶挥发物作用更为持久。