锌指核酶技术是近年来发展起来的基因打靶技术,能够特异性识别基因组内的位点,并在识别位点对DNA进行剪切,形成双链断裂(DSB)。DSB通过非同源性末端连接(NHEJ)或同源重组(HR)的方式进行修复。通过NHEJ方式修复DSB时,可能会引入碱基的插入或缺失,造成基因突变。而通过HR方式修复时,不会引起突变,但当存在含有同源臂的外源基因时,可能会将外源基因整合到该位点,实现基因打靶。本研究首先分离了牛成纤维细胞、肌肉间充质细胞和脂肪间充质细胞。这些细胞都能够在DMEM培养基和10%胎牛血清构成的完全培养基中培养和传代。通过分化培养,牛肌肉间充质细胞能够分化为肌管细胞和脂肪细胞；脂肪间充质细胞能够分化为脂肪细胞,脂肪滴能被油红O染色,并且在分化形成的肌肉细胞中能够观察到肌管细胞的收缩现象。对两种间充质细胞使用Vimentin抗体进行免疫荧光染色,可以发现二者都具有Vimentin的表达,说明这些细胞具备间充质细胞的性质。牛肌肉间充质细胞能够表达MYOG、MYOD口MYF5三种肌源基因。从胎儿耳部组织获得的成纤维细胞具有典型的成纤维细胞特征。选取牛成纤维细胞和牛肌肉间充质细胞作为后续实验的主要材料。本研究设计了两组针对牛肌肉抑制素基因(Myostatin, MSTN)第二外显子的ZFNs (bZFNs-P1和bZFNs-P2),利用脂质体转染的方法将ZFNs载体转入牛成纤维细胞和肌肉间充质细胞中,通过PCR和测序检测突变体,最终获得了18个突变体细胞系(bZFNs-P1获得14个敲除细胞系,bZFNs-P2获得4个敲除细胞系,包括一株双等位基因敲除细胞系)。两组ZFNs的敲除效率分别为6.05%和3.84%。选取其中一株突变细胞系KO-241,检测核型正常后,作为体细胞核移植供体细胞,制备了24枚重构胚。获得的重构胚去除透明带后,培养于2i培养液环境下的牛成纤维细胞饲养层上,获得了牛滋养层干细胞。牛滋养层干细胞呈球状和片状生长。其MSTN位点的突变类型与供体细胞相同。为了提高牛肌间不饱和脂肪酸的含量,同时研究锌指核酶在牛成纤维细胞中介导的基因打靶效率,设计构建了两个针对bZFNs-P2靶向位点的打靶质粒,分别为pflrkt-1和pGlrkt-1,其外源基因分别为人源化的Fat-1(hFat-1)和EGFP,两侧都带有800-900bp的同源臂,用于将外源基因整合到MSTN基因第二外显子。由于脂质体转染效率不足以实现三个以上质粒共转染,所以首先优化了牛成纤维细胞的电转染条件,在使用电压为200V,脉冲时间为5ms,脉冲次数为2次的条件下,获得了最高的约60%的转染效率。之后利用电转染方式将3个质粒共转入牛成纤维细胞。经过G418筛选和同源臂跨臂PCR检测,共获得了2株打靶细胞34f6和34GF8。打靶效率为10%和7%。34GF8细胞系在荧光显微镜下能够观察到绿色荧光蛋白的表达,而通过实时定量PCR检测34f6的hFat-1基因表达情况发现,该基因能够在MSTN位点表达。本研究利用ZFNs技术成功将牛MSTN进行突变,获得了18株突变细胞系(包含一株双等位基因细胞系),并使用较短的同源臂,将外源基因高效地整合到了牛MSTN基因位点,外源基因能够在该位点表达。研究表明ZFN技术能够在家畜的转基因研究中发挥重要作用,减少转基因动物研究中的人力、物力和时间成本,提高了转基因技术在动物生产上的生物安全性,推动转基因技术的发展。